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有关Ni Bestarose HP柱材的再生
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| 如题，我用的是Ni Bestarose HP柱材，纯化His标记的蛋白，初次使用的时候好像效果还好，目前目标蛋白结合不上柱子，所以想问问有没有关于Ni柱再生的方面的操作或者是手册什么的，希望贡献一下！谢谢各位！ |
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 Ni柱再生方法 |
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4楼2013-08-26 13:57:37
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396101466(金币+1): 谢谢参与
396101466(金币+1): 谢谢参与
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Ni 柱重生一般常用的步骤是： 1. ddH2O洗5CV，6M盐酸胍洗1-2CV（这里流速慢点，浸泡也行的，我一般第一个CV泡1h，再加等体积的盐酸胍浸泡2h），多洗点柱体积就更好了。如果填料实在很脏的话，可以用NaOH洗，但要先查找该款Ni柱的基架耐受的NaOH浓度。 2. ddH2O洗10CV，然后用100mM EDTA洗1-2CV（流速要慢点，要把Ni柱洗白，Ni充分的被EDTA螯合下来） 3. ddH2O洗10CV，然后用200mM NiSO4上柱1-2CV（流速要慢，让Ni充分挂柱，或者1CV直接浸泡过夜也行） 4. ddH2O洗10CV，然后20%乙醇洗2CV，4度保存即可。 以上柱体积的量可以适当增加点，效果更好点。 还有就是蛋白不挂柱子，不一定就是柱子的问题，有可能是蛋白本身的问题，也有可能是缓冲液不合适影响了蛋白的性质。如果真是填料一点都不结合目的蛋白，那柱子得有多脏啊。。。。你可以取点柱子，加点loading buffer煮一下，跑个SDS-PAGE看看，是否上面残留量很多蛋白，当然柱子看起来得是蓝色/绿色的，确认还有Ni的存在。 |
2楼2013-08-22 13:42:14