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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


内容已删除
51楼2013-08-21 10:06:03
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


引用回帖:
50楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-20 21:32:08
公司买的抗体特异性一般是不错的。如有可能,阴性对照一般使用该蛋白基因突变株。...

这个对照有做的,也是转过去的蛋白都能显色,交叉反应会这么严重吗?!
52楼2013-08-21 10:12:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
52楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-21 10:12:09
这个对照有做的,也是转过去的蛋白都能显色,交叉反应会这么严重吗?!...

可能是封闭不理想或者洗膜不充分。此外,还可以增加抗体稀释倍数。
53楼2013-08-21 11:01:01
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


引用回帖:
53楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-21 11:01:01
可能是封闭不理想或者洗膜不充分。此外,还可以增加抗体稀释倍数。...

封闭是过夜的,应该不会不够吧,现在又在做,增加了抗体的稀释倍数了
54楼2013-08-21 16:14:26
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飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
我个人认为:如果抗体没有问题,楼主的实验异常应该是形成了WB的背景过高,可能原因如下:
未进行非特异性封闭或封闭不充分(延长封闭时间,考虑更换合适的封闭剂,我们推荐
5%脱脂奶粉、3%BSA或血清封闭30分钟);
一抗浓度过高(稀释抗体至合适浓度,以更高稀释度抗体延长孵育时间,耗时长但特异
性结合最好);
抗体孵育温度过高(4℃孵育);
二抗与封闭液非特异性结合或反应(设置二抗对照,不加一抗);
未结合蛋白质洗涤不充分(增加洗涤次数);
选膜不当产生的高背景(NC膜比PVDF膜背景低);
膜干燥(在孵育过程中防止膜变干,每一步都要保证膜有充分的反应液);
55楼2013-08-21 23:50:02
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


引用回帖:
55楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-21 23:50:02
我个人认为:如果抗体没有问题,楼主的实验异常应该是形成了WB的背景过高,可能原因如下:
未进行非特异性封闭或封闭不充分(延长封闭时间,考虑更换合适的封闭剂,我们推荐
5%脱脂奶粉、3%BSA或血清封闭30分钟) ...

封闭是用的10%脱脂奶粉过夜,一抗是根据说明书稀释了700倍,室温孵育了4h,用的0.45um的PVDF膜。
抗体孵育温度过高也会有影响的吗?二抗对照应该要怎么样做呢?是在另一张膜上进行吗?还有就是为什么大分子的蛋白用0.2um的膜会转不过去呢?!
56楼2013-08-22 08:57:14
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doctor俊

新虫 (初入文坛)



飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
应该不是膜的关系,可能与所用抗体和抗体洗脱有关系吧
57楼2013-08-22 09:10:57
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


引用回帖:
57楼: Originally posted by doctor俊 at 2013-08-22 09:10:57
应该不是膜的关系,可能与所用抗体和抗体洗脱有关系吧

我是用含0.15%吐温的TBST洗的,一抗孵育结束洗了3次,每次10分钟,二抗孵育结束以后洗了5次,每次10分钟,显色后发现背景深又继续洗的,还是那样
58楼2013-08-22 09:19:42
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huangdan1003

新虫 (初入文坛)



飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
建议优化抗体浓度
59楼2013-08-22 10:45:13
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