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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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51楼2013-08-21 10:06:03
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
50楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-20 21:32:08
公司买的抗体特异性一般是不错的。如有可能，阴性对照一般使用该蛋白基因突变株。...

这个对照有做的，也是转过去的蛋白都能显色，交叉反应会这么严重吗？！
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52楼2013-08-21 10:12:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
52楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-21 10:12:09
这个对照有做的，也是转过去的蛋白都能显色，交叉反应会这么严重吗？！...

可能是封闭不理想或者洗膜不充分。此外，还可以增加抗体稀释倍数。
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53楼2013-08-21 11:01:01
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
53楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-21 11:01:01
可能是封闭不理想或者洗膜不充分。此外，还可以增加抗体稀释倍数。...

封闭是过夜的，应该不会不够吧，现在又在做，增加了抗体的稀释倍数了
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54楼2013-08-21 16:14:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
我个人认为：如果抗体没有问题，楼主的实验异常应该是形成了WB的背景过高，可能原因如下：
未进行非特异性封闭或封闭不充分（延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂，我们推荐
5%脱脂奶粉、3%BSA或血清封闭30分钟）；
一抗浓度过高（稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间，耗时长但特异
性结合最好）；
抗体孵育温度过高（4℃孵育）；
二抗与封闭液非特异性结合或反应（设置二抗对照，不加一抗）；
未结合蛋白质洗涤不充分（增加洗涤次数）；
选膜不当产生的高背景（NC膜比PVDF膜背景低）；
膜干燥（在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液）；
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55楼2013-08-21 23:50:02
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
55楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-21 23:50:02
我个人认为：如果抗体没有问题，楼主的实验异常应该是形成了WB的背景过高，可能原因如下：
未进行非特异性封闭或封闭不充分（延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂，我们推荐
5%脱脂奶粉、3%BSA或血清封闭30分钟） ...

封闭是用的10%脱脂奶粉过夜，一抗是根据说明书稀释了700倍，室温孵育了4h，用的0.45um的PVDF膜。
抗体孵育温度过高也会有影响的吗？二抗对照应该要怎么样做呢？是在另一张膜上进行吗？还有就是为什么大分子的蛋白用0.2um的膜会转不过去呢？！
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56楼2013-08-22 08:57:14
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doctor俊

新虫 (初入文坛)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
应该不是膜的关系,可能与所用抗体和抗体洗脱有关系吧
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57楼2013-08-22 09:10:57
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
57楼: Originally posted by doctor俊 at 2013-08-22 09:10:57
应该不是膜的关系,可能与所用抗体和抗体洗脱有关系吧

我是用含0.15%吐温的TBST洗的，一抗孵育结束洗了3次，每次10分钟，二抗孵育结束以后洗了5次，每次10分钟，显色后发现背景深又继续洗的，还是那样
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58楼2013-08-22 09:19:42
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huangdan1003

新虫 (初入文坛)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
建议优化抗体浓度
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59楼2013-08-22 10:45:13
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