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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

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[交流] wb

最近在做WB,但是总数出问题，最初是用0.2um的PVDF膜做的，但是发光后没有亮带，后来改为0.45um的PVDF膜，转过去的蛋白全部都发光，技术说是发生了交叉反应，如果是这样的话不是说抗体没有特异性了吗，还有哪位大侠知道是什么原因啊，应该要怎么样改进

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1楼 2013-08-20 10:27:17

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我个人认为：如果抗体没有问题，楼主的实验异常应该是形成了WB的背景过高，可能原因如下：
未进行非特异性封闭或封闭不充分（延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂，我们推荐
5%脱脂奶粉、3%BSA或血清封闭30分钟）；
一抗浓度过高（稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间，耗时长但特异
性结合最好）；
抗体孵育温度过高（4℃孵育）；
二抗与封闭液非特异性结合或反应（设置二抗对照，不加一抗）；
未结合蛋白质洗涤不充分（增加洗涤次数）；
选膜不当产生的高背景（NC膜比PVDF膜背景低）；
膜干燥（在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液）；