| 查看: 1331 | 回复: 6 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
shucaiyuanyi银虫 (小有名气)
|
[交流]
求助菌落PCR的技术流程
|
||
|
求助菌落PCR的技术流程 查了好多资料,都没有详细的技术流程,希望各位帮下忙啊 , 在下感激不尽!! [ Last edited by telomerase on 2007-11-13 at 11:10 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
有多少人是今天查系统知道结果的？
已经有18人回复
-
为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难
已经有12人回复
-
有没有仍没收到信息的
已经有3人回复
-
导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！
已经有8人回复
-
基金不中，共勉
已经有11人回复
-
麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上）
已经有9人回复
-
2026年叶企孙基金
已经有6人回复
-
国自然面上复盘~欢迎讨论
已经有13人回复
-
基金系统什么内容也没有
已经有9人回复
-
怎么查啊
已经有6人回复
★ ★ ★
telomerase(金币+2,VIP+0):谢谢应助！！欢迎多多参与交流！！
asr(金币+1,VIP+0):thanks,辛苦了.
telomerase(金币+2,VIP+0):谢谢应助！！欢迎多多参与交流！！
asr(金币+1,VIP+0):thanks,辛苦了.
|
常规的大概流程是：1. 挑菌；2. 摇菌；3. 提取菌液DNA（可采用试剂盒）；4. 构建PCR体系并进行PCR；5.电泳检测结果。 具体操作在文章上都可查到，当然必要时可根据你的具体要求对实验操作进行一些更改. 还有一种比较简便的方法就是菌落PCR（Colony PCR），优点是可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。 具体方法： 1、PCR混合物的制备 Taq buffer（10×） 20 ul dNTP（2.5 mM） 5 ul Primer Forward（50 mM） 10 ul Primer Reverse（50 mM） 10 ul ddH2O 147 ul Taq（2U/ul） 8 ul total 200 ul 将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。 2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。 3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。 4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。 注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。 [ Last edited by yangchang1018 on 2007-11-13 at 11:30 ] |
2楼2007-11-13 11:19:33
3楼2007-11-13 11:29:31
reasonspare
木虫 (著名写手)
- BioEPI: 10
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.894
- 金币: 2137.1
- 红花: 11
- 帖子: 1909
- 在线: 72.5小时
- 虫号: 180928
- 注册: 2006-02-10
- 专业: All in one
4楼2007-11-13 11:40:39
5楼2007-11-13 19:56:06
shucaiyuanyi
银虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 243.3
- 红花: 1
- 帖子: 91
- 在线: 23.1小时
- 虫号: 447430
- 注册: 2007-11-01
- 性别: GG
- 专业: 蔬菜学与瓜果学
6楼2007-11-13 22:54:45
glucidum
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 3260.6
- 散金: 522
- 帖子: 436
- 在线: 80.4小时
- 虫号: 422557
- 注册: 2007-07-15
- 性别: GG
- 专业: 食用真菌学
7楼2007-11-14 08:55:58
10