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hugh_hang至尊木虫 (正式写手)
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[求助]
要用HPLC测微藻粉内 葡萄糖 氨基酸 脂肪酸 含量
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如题，我做的课题要测微藻细胞内 葡萄糖 3种氨基酸 4种脂肪酸 的含量，老板说用高效液相色谱HPLC可以测定，要我查样品要怎样处理才能测定。 以前用化学方法测的时候我们仅对藻粉做了溶解&破细胞壁的处理后就按相应方法测定了，但我没接触过HPLC，所以想问一下要HPLC测定要怎样处理样品？同一样品测定以上三类物质的处理有何不同，测了比如葡萄糖后的样品能否再测脂肪酸？或者哪些物质的测定是可以一起处理一起测定的？ |
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【答案】应助回帖
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hugh_hang: 回帖置顶 2014-03-14 15:40:25
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材料与方法1.1 仪器设备 Agilent1100高效液相色谱仪，包 括：真空脱气机、双元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）和化学工作站，美国Agilent公司；电热恒温干燥箱（最高温度350℃，控温精度±1℃），日本Yamato公司；高速 台式离心机（最大转速14000r/min）， 德国Hettich公司；旋转蒸发器，德国IKA公司。 1.2试剂及配制甲醇、乙腈（色谱纯），美国Fish-er公司；NaH2PO4·H2O（分析纯），美国Sigma-Aldrich公司；硼酸缓冲液、邻苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC）和17种氨基酸标准混合液，包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸，Ag-ilent公司；色氨酸和内标戊氨酸，美国Sigma-Aldrich公司。HCl（优级纯）、巯基乙醇、NaOH（分析纯），北京化学试剂厂；水为双蒸水。 内标溶液配制：准确称取适量戊氨酸，用0.1mol/LHCl配制成浓度为50mmol/L的内标贮存液，临用时稀释。 氨基酸混合标准液的配制：准确称取适量色氨 酸，用0.1mol/LHCl配制成浓度为18mmol/L的贮 存液，临用时稀释。将不同浓度的17种氨基酸混合标准液与适当浓度的戊氨酸和色氨酸溶液按一定比 例混合，配制成浓度分别为4.5、45、225、450和1000μmol/L的氨基酸混合标准溶液（内标戊氨酸 浓度均为250μmol/L）。 冬虫夏草样品：分别产自青海省果洛州和玉树州、四川甘孜州、贵州铜仁市和西藏那曲县，由吉林大学生命科学学院提供。 1.3样品制备水解氨基酸样品制备按照参考 文献［7］ 中样品制备项下样品酸水解法进行。 1.4 色谱条件色谱柱：ZorbaxEclipseAAAC18 柱， 75mm×4.6mm，3.5μm。流动相A：40mmol/LNaH2PO4·H2O溶液，pH=7.8。流动相B：乙腈/甲 醇/水=45/45/10（v/v）。流动相梯度洗脱程序：0.0～1.0min（B：0%），1.0～9.8min（B：0%～57%），9.8～10.0min（B：57%～100%），10.0～12.0min（B：100%），12.0～12.5min（B：100%～0%）， 12.5～14.0min（B：0%）。流速：2mL/min。柱温：40℃。DAD检测波长：0～8.5min，紫外波长338nm（谱带宽10nm），参考波长390nm（谱带宽20nm）；FLD检测波长：0.0～8.5min（激发波长340nm，发射波长450nm），8.5～14.0min（激发波长266nm，发射波长305nm）。自动衍生程序：分别吸取2.5μL硼酸缓冲液和0.5μL标准溶液或样品水解液， 充分混合，静置30s；洗针；吸取0.5μLOPA充分混合；洗针；吸取0.5μLFMOC充分混合；吸取32μL水，充分混合；进样量18μL。 HPLC测定不同产地冬虫夏草中氨基酸的含量 都擦不多 |
4楼2013-08-16 20:46:03
hugh_hang
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2楼2013-08-16 09:10:30
laozuzunzhe
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3楼2013-08-16 10:37:52
hugh_hang
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5楼2013-08-17 18:40:27
hugh_hang
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6楼2013-08-19 12:42:40
【答案】应助回帖
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前一段时间 电脑坏了 文件丢了 不好意思 这个可不可以 水为石英亚沸蒸馏水并用Mill-iQ50(美国Mi-l 在室温(18~ 25 )下几种成分不能很好地分 lipore公司)超纯水仪处理; EDTA钙钠(高效液相 离,峰型也比较差,而且色谱柱反压大,容易损伤色 色谱专用,Waters公司提供)。 谱柱;柱温保持在70~90 之间可使几种组分得到 1.2 色谱条件 较好的分离且柱反压小,试验控制柱温为85 。 色谱柱:WatersSugar-Pak-1钙型阳离子交换柱 2.4 样品前处理 (6.5mm 300mm),WatersSep-Pak-C 固相萃取小 饮料中除了糖、甘油和乙醇外,还含有其它干扰 18 柱,Sep-PakAluminCartridges保护柱;流动相为0. 组分,如色素、防腐剂、抗氧化剂、有机酸、无机盐、颗 05g L-1EDTA钙钠水溶液,流速为0.5ml min-1; 粒物等。色素、防腐剂、抗氧化剂相对于糖、甘油和 柱温为85 ;进样量为20 l。 乙醇疏水性强,易附着在柱材料上不被流动相洗脱 标样色谱图和饮料样品色谱图见图1。 而降低柱效,有机酸和无机盐(特别是过渡金属元 素)易取代柱材料上的钙而腐蚀色谱柱,所以在进样 之前要预分离这些成分。本文采用Sep-PakC 固 18 相萃取小柱固相萃取预分离,样品通过小柱时由于 测定组分亲水性极强,在柱上没有保留,而色素、防 腐剂、抗氧化剂等相对于测定组分疏水性较强,在小 柱上有保留,这样过柱可预分离去除大部份色素、防 腐剂、抗氧化剂等。用WatersSPE真空提取装置, 每次可同时处理20个样,小柱活化和样品富集的流 速均为10ml min-1,小柱用15ml甲醇活化,再用 图1 标样色谱图(b)和饮料样品色谱图(a) 30ml水洗去甲醇,样品以10ml min-1流速通过小 Fig. 1 Chromatogramsofstandardsample(b) anddrinksample(a) 柱,弃去最初的2ml,收集后面的3ml,用4.5 m滤 1. 蔗糖(Sucrose) 2.葡萄糖(Glucose) 3. 果糖(Fructose) 膜过滤,取20 l进样分析,这样可除去水难溶成分 4.甘油(Glycerol) 5. 乙醇(Ethanol) 和颗粒成分。少量有机酸和无机盐等用Sep-PakA- luminCartridges保护柱在线除去。 1.3 样品处理 2.5 回归方程、相关系数及检出限 取饮料样品5ml,以10ml min-1流速通过预活 取标准溶液配制成 0. 008, 0. 040, 0. 200, 化好的Sep-PakC 固相萃取小柱,弃去最初的2ml,18 1 000,5.000mg ml-1系列标准溶液,进样后计算出 收集后面的3ml,用4.5 m针头过滤器过滤,取20 l 不同浓度的峰面积,计算回归方程。根据信噪比S/ 进样分析。 N=3,测得各组分检出限,结果见表1。 2 结果与讨论 表1 回归方程、相关系数及检出限 Tab.1 Regressionequationcorrelationcoefficient 2.1 检测器的选择 anddetectionlimits 由于待测定物在紫外光区无吸收,而且待测物 检出限 相关系数 组分 回归方程 Detection 在样品中的含量较高,选用示差折光检测器检测。 Correlation Components Regressionequation limits coefficient 2.2 流动相的选择 ( / g ml-1) 根据色谱柱说明书和文献[6],WatersSuga-r A(峰面积)=1532+ 蔗糖 0.9998 2.0 1.633 108C(mg ml-1) Pak-1钙型阳离子交换柱一般以水作流动相,水中 A(峰面积)=1527+ 加入少量EDTA钙钠可减少柱材料上的钙离子流 葡萄糖 0.9998 2.5 1.867 108C(mg ml-1) 失,延长柱的寿命;流动相也可加入少于5%的甲 A(峰面积)=1295+ 果糖 0.9997 2.0 醇、乙晴或四氢呋喃等亲水性有机溶剂作调节剂。 1.889 108C(mg ml-1) 但对于本法的分离组分,加有机溶剂对分离没 |
7楼2013-10-16 22:18:20
hugh_hang
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8楼2013-10-19 09:51:13