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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 要用HPLC测微藻粉内 葡萄糖 氨基酸 脂肪酸 含量
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hugh_hang

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 要用HPLC测微藻粉内 葡萄糖 氨基酸 脂肪酸 含量

如题，我做的课题要测微藻细胞内 葡萄糖 3种氨基酸 4种脂肪酸 的含量，老板说用高效液相色谱HPLC可以测定，要我查样品要怎样处理才能测定。
以前用化学方法测的时候我们仅对藻粉做了溶解&破细胞壁的处理后就按相应方法测定了，但我没接触过HPLC，所以想问一下要HPLC测定要怎样处理样品？同一样品测定以上三类物质的处理有何不同，测了比如葡萄糖后的样品能否再测脂肪酸？或者哪些物质的测定是可以一起处理一起测定的？
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miracles happen everyday, some people don't think so but they do!
1楼 2013-08-14 21:35:45
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蒋衍东

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-08-19 19:45:06
hugh_hang: 回帖置顶 2014-03-14 15:40:25
材料与方法1.1
仪器设备
Agilent1100高效液相色谱仪，包
括：真空脱气机、双元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）和化学工作站，美国Agilent公司；电热恒温干燥箱（最高温度350℃，控温精度±1℃），日本Yamato公司；高速
台式离心机（最大转速14000r/min），
德国Hettich公司；旋转蒸发器，德国IKA公司。
1.2试剂及配制甲醇、乙腈（色谱纯），美国Fish-er公司；NaH2PO4·H2O（分析纯），美国Sigma-Aldrich公司；硼酸缓冲液、邻苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC）和17种氨基酸标准混合液，包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙
氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸，Ag-ilent公司；色氨酸和内标戊氨酸，美国Sigma-Aldrich公司。HCl（优级纯）、巯基乙醇、NaOH（分析纯），北京化学试剂厂；水为双蒸水。
内标溶液配制：准确称取适量戊氨酸，用0.1mol/LHCl配制成浓度为50mmol/L的内标贮存液，临用时稀释。
氨基酸混合标准液的配制：准确称取适量色氨
酸，用0.1mol/LHCl配制成浓度为18mmol/L的贮
存液，临用时稀释。将不同浓度的17种氨基酸混合标准液与适当浓度的戊氨酸和色氨酸溶液按一定比
例混合，配制成浓度分别为4.5、45、225、450和1000μmol/L的氨基酸混合标准溶液（内标戊氨酸
浓度均为250μmol/L）。
冬虫夏草样品：分别产自青海省果洛州和玉树州、四川甘孜州、贵州铜仁市和西藏那曲县，由吉林大学生命科学学院提供。
1.3样品制备水解氨基酸样品制备按照参考
文献［7］
中样品制备项下样品酸水解法进行。
1.4
色谱条件色谱柱：ZorbaxEclipseAAAC18
柱，
75mm×4.6mm，3.5μm。流动相A：40mmol/LNaH2PO4·H2O溶液，pH=7.8。流动相B：乙腈/甲
醇/水=45/45/10（v/v）。流动相梯度洗脱程序：0.0～1.0min（B：0%），1.0～9.8min（B：0%～57%），9.8～10.0min（B：57%～100%），10.0～12.0min（B：100%），12.0～12.5min（B：100%～0%），
12.5～14.0min（B：0%）。流速：2mL/min。柱温：40℃。DAD检测波长：0～8.5min，紫外波长338nm（谱带宽10nm），参考波长390nm（谱带宽20nm）；FLD检测波长：0.0～8.5min（激发波长340nm，发射波长450nm），8.5～14.0min（激发波长266nm，发射波长305nm）。自动衍生程序：分别吸取2.5μL硼酸缓冲液和0.5μL标准溶液或样品水解液，
充分混合，静置30s；洗针；吸取0.5μLOPA充分混合；洗针；吸取0.5μLFMOC充分混合；吸取32μL水，充分混合；进样量18μL。
HPLC测定不同产地冬虫夏草中氨基酸的含量 都擦不多
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4楼2013-08-16 20:46:03
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普通回帖

hugh_hang

至尊木虫 (正式写手)
自顶一记，拜托各位虫友了，谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
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miracles happen everyday, some people don't think so but they do!
2楼2013-08-16 09:10:30
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laozuzunzhe

铁杆木虫 (著名写手)
帮忙顶一下，了解的虫友积极应助哈！！！
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3楼2013-08-16 10:37:52
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hugh_hang

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 蒋衍东 at 2013-08-16 20:46:03
材料与方法1.1
仪器设备
Agilent1100高效液相色谱仪，包
括：真空脱气机、双元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）和化学工作站，美国Agilent公司；电热恒温干燥箱（最高温度35 ...

先谢谢，不过麻烦把文献[7]给一下可以吗？最好也能分享整篇文章~
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miracles happen everyday, some people don't think so but they do!
5楼2013-08-17 18:40:27
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hugh_hang

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 蒋衍东 at 2013-08-16 20:46:03
材料与方法1.1
仪器设备
Agilent1100高效液相色谱仪，包
括：真空脱气机、双元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）和化学工作站，美国Agilent公司；电热恒温干燥箱（最高温度35 ...

麻烦把文献[7]或者整篇文章分享一下好吗。谢谢！
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miracles happen everyday, some people don't think so but they do!
6楼2013-08-19 12:42:40
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蒋衍东

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

前一段时间 电脑坏了 文件丢了 不好意思
这个可不可以
水为石英亚沸蒸馏水并用Mill-iQ50(美国Mi-l 在室温(18~ 25 )下几种成分不能很好地分
lipore公司)超纯水仪处理; EDTA钙钠(高效液相 离,峰型也比较差,而且色谱柱反压大,容易损伤色
色谱专用,Waters公司提供)。 谱柱;柱温保持在70~90 之间可使几种组分得到
1.2  色谱条件 较好的分离且柱反压小,试验控制柱温为85 。
色谱柱:WatersSugar-Pak-1钙型阳离子交换柱 2.4  样品前处理
(6.5mm 300mm),WatersSep-Pak-C 固相萃取小 饮料中除了糖、甘油和乙醇外,还含有其它干扰
18
柱,Sep-PakAluminCartridges保护柱;流动相为0. 组分,如色素、防腐剂、抗氧化剂、有机酸、无机盐、颗
05g L-1EDTA钙钠水溶液,流速为0.5ml min-1; 粒物等。色素、防腐剂、抗氧化剂相对于糖、甘油和
柱温为85 ;进样量为20 l。 乙醇疏水性强,易附着在柱材料上不被流动相洗脱
标样色谱图和饮料样品色谱图见图1。 而降低柱效,有机酸和无机盐(特别是过渡金属元
素)易取代柱材料上的钙而腐蚀色谱柱,所以在进样
之前要预分离这些成分。本文采用Sep-PakC 固
18
相萃取小柱固相萃取预分离,样品通过小柱时由于
测定组分亲水性极强,在柱上没有保留,而色素、防
腐剂、抗氧化剂等相对于测定组分疏水性较强,在小
柱上有保留,这样过柱可预分离去除大部份色素、防
腐剂、抗氧化剂等。用WatersSPE真空提取装置,
每次可同时处理20个样,小柱活化和样品富集的流
速均为10ml min-1,小柱用15ml甲醇活化,再用
图1  标样色谱图(b)和饮料样品色谱图(a)
30ml水洗去甲醇,样品以10ml min-1流速通过小
Fig. 1  Chromatogramsofstandardsample(b)
anddrinksample(a)
柱,弃去最初的2ml,收集后面的3ml,用4.5 m滤
1. 蔗糖(Sucrose)  2.葡萄糖(Glucose) 3. 果糖(Fructose) 膜过滤,取20 l进样分析,这样可除去水难溶成分
4.甘油(Glycerol)  5. 乙醇(Ethanol) 和颗粒成分。少量有机酸和无机盐等用Sep-PakA-
luminCartridges保护柱在线除去。
1.3  样品处理
2.5  回归方程、相关系数及检出限
取饮料样品5ml,以10ml min-1流速通过预活
取标准溶液配制成 0. 008, 0. 040, 0. 200,
化好的Sep-PakC 固相萃取小柱,弃去最初的2ml,18
1 000,5.000mg ml-1系列标准溶液,进样后计算出
收集后面的3ml,用4.5 m针头过滤器过滤,取20 l
不同浓度的峰面积,计算回归方程。根据信噪比S/
进样分析。
N=3,测得各组分检出限,结果见表1。
2
  结果与讨论 表1  回归方程、相关系数及检出限
Tab.1  Regressionequationcorrelationcoefficient
2.1  检测器的选择
anddetectionlimits
由于待测定物在紫外光区无吸收,而且待测物 检出限
相关系数
组分 回归方程 Detection
在样品中的含量较高,选用示差折光检测器检测。 Correlation
Components Regressionequation limits
coefficient
2.2  流动相的选择 ( / g ml-1)
根据色谱柱说明书和文献[6],WatersSuga-r A(峰面积)=1532+
蔗糖 0.9998 2.0
1.633 108C(mg ml-1)
Pak-1钙型阳离子交换柱一般以水作流动相,水中
A(峰面积)=1527+
加入少量EDTA钙钠可减少柱材料上的钙离子流 葡萄糖 0.9998 2.5
1.867 108C(mg ml-1)
失,延长柱的寿命;流动相也可加入少于5%的甲
A(峰面积)=1295+
果糖 0.9997 2.0
醇、乙晴或四氢呋喃等亲水性有机溶剂作调节剂。 1.889 108C(mg ml-1)
但对于本法的分离组分,加有机溶剂对分离没
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7楼2013-10-16 22:18:20
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hugh_hang

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蒋衍东 at 2013-10-16 22:18:20
前一段时间 电脑坏了 文件丢了 不好意思
这个可不可以
水为石英亚沸蒸馏水并用Mill-iQ50(美国Mi-l 在室温(18~ 25 )下几种成分不能很好地分
lipore公司)超纯水仪处理; EDTA钙钠(高效液相 离,峰型也比较差,而且色谱 ...

谢谢，我已找到其他方法了

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8楼2013-10-19 09:51:13
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