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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » pET28表达蛋白的问题
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sgh07ok

金虫 (著名写手)

[交流] pET28表达蛋白的问题

用pET28表达三个蛋白，一样的酶切位点，其余两个都表达出来了，只有一个没有表达出来。PS：测序结果是三个蛋白序列完全正确的。有没有人能指点一下，找出原因:
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1楼 2013-08-14 10:51:09
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fliton

木虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by ~艾斯~ at 2013-09-21 22:09:14
嗯，我前两天做了一个类似的实验，做着玩的，不过就是没有表达出来~比较郁闷~~应该跟IPTG没啥关系吧~因为我加了也是没有表达出来~

你是怎么检测的呀？考马斯亮蓝染色还是western检测？
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23楼2013-10-31 15:11:13
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普通回帖

ms0321021

铁虫 (初入文坛)
★
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
最近我也需要做，但是你的问题我不懂
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2楼2013-08-14 21:03:45
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
★
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
大小有差异，还是条件有差异？
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3楼2013-08-15 00:47:29
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sgh07ok

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-15 00:47:29
大小有差异，还是条件有差异？

只是大小有差异，别的都一样，克隆的酶切位点都是一样的
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4楼2013-08-15 11:50:33
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sgh07ok at 2013-08-15 11:50:33
只是大小有差异，别的都一样，克隆的酶切位点都是一样的...

估计你这个比较大吧
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6楼2013-08-16 10:50:56
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sgh07ok

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-16 10:50:56
估计你这个比较大吧...

不是啊，我的三个蛋白中，没表达出来的这个最小了，只有14kD
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7楼2013-08-16 12:34:33
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hanmiao0122

无虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
nono2009: 金币-10, 违规存档, 严禁回帖广告 2013-09-02 20:49:39
本帖内容被屏蔽
9楼2013-08-18 09:29:57
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
★
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
10楼2013-08-18 10:07:36
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sgh07ok

金虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by aotoulan at 2013-08-18 10:07:36
我也遇到过这样的事，辛辛苦苦几个周，结果就没结果了。。。楼主可以试试改变表达温度时间等，或者重新构建表达

嗯，我试试重新构一个质粒
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11楼2013-08-18 11:18:46
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gaofz487

禁虫 (初入文坛)
★
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
14楼2013-08-30 22:56:20
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sgh07ok

金虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by gaofz487 at 2013-08-30 22:56:20
应该是诱导条件的问题，可以换一下诱导培养基，调整诱导温度，IPTG浓度

嗯，现在就在摸索这些条件呢
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15楼2013-08-31 13:37:21
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~艾斯~

银虫 (正式写手)
嗯，我前两天做了一个类似的实验，做着玩的，不过就是没有表达出来~比较郁闷~~应该跟IPTG没啥关系吧~因为我加了也是没有表达出来~
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19楼2013-09-21 22:09:14
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wanghuanyi

金虫 (小有名气)
我也遇到类似的问题 不知道怎么回事
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20楼2013-09-23 21:46:49
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lksyb

金虫 (正式写手)
什么来源的基因，会不会是稀有密码子的问题？
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21楼2013-09-25 01:06:38
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testgfri

新虫 (小有名气)
检查是否表达为包涵体，个人觉得低温诱导可以试试，也许有效，比如30度诱导过夜
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22楼2013-10-29 16:41:18
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fliton

木虫 (小有名气)
你是怎么检测的呀？考马斯亮蓝染色还是western检测？我也遇到了同样的问题，望共同进步呀
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24楼2013-10-31 15:11:28
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~艾斯~

银虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by fliton at 2013-10-31 15:11:13
你是怎么检测的呀？考马斯亮蓝染色还是western检测？...

啊，我那个转录里面有GFP，所以在紫外下看一眼有荧光绿就行~
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25楼2013-11-01 08:25:27
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sxdthy

新虫 (小有名气)
你是28a还是28b啊？是不是实验中的操作问题呢？建议多做几次，分子这个东西就是很奇怪，楼主攒攒人品吧
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26楼2013-11-02 11:22:37
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wei-feng

铁杆木虫 (小有名气)
请问楼主，你的蛋白多少个AA呀？
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27楼2013-12-27 21:47:48
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yingying15885楼
2013-08-15 22:48   回复  
sgh07ok(金币+1): 谢谢参与
neu2348楼
2013-08-17 09:28   回复  
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风影一生12楼
2013-08-20 17:17   回复  
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yingying158813楼
2013-08-20 21:02   回复  
yingying158816楼
2013-08-31 18:44   回复  
spbee17楼
2013-09-02 11:11   回复  
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nono200918楼
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