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feizizi3

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 高人，帮我看看金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳图已有1人参与

请问加了溶葡萄球菌酶之后要不要37℃水浴？为什么我的菌跑不出来？

我做的过程是按照国标的：
1）菌悬液的制备
（1）在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入1ml TE缓冲液。
① 在1.5ml eppendorf 管上标记好对应样品的名称。
② 用棉棒，从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于TE中，用eppendorf分光光度计测其OD值，调整至5.5-6.5之间，如果OD值大于6.5，加入TE稀释；如果OD值小于5.5，增加菌量提高其浓度。
注：如果样品数量多，调完OD后先存放于4℃。
③ 取250ul菌悬液于相应约1.5ml eppendorf管中。
④ 加入2ul溶葡萄球菌酶（1mg/ml），用移液枪充分吹打，不需振荡摇匀。
2）胶块的制备
（1）准备10ml的1%SKG(称取0.1gSKG溶于纯水，用微波炉加热至完全溶解，放在53℃~56℃水浴中)。
（2）取250ul预热（53℃~56℃）的SKG，与300ul菌悬液混合，用移液枪轻轻吹打5次左右至液体均匀，避免产生气泡。混合前菌悬液可在水浴里预热10秒，并摇匀。
（3）将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10-15分钟或置于4℃冰箱5分钟。
3）细胞的裂解
（1）在50ml的sctew-cap tube 上做好标记。
（2）制备细胞裂解液（CLB），参见下表。蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。
样本数量 CLB 蛋白酶K(20mg/ml)
1 4ml 30ul
10 40 ml 300ul
13 52 ml 390ul
15 60 ml 450ul
20 80 ml 600ul
(3)毎个管子加入4ml蛋白酶K/CLB混合液。
（4）如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。
①可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。
②一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
（5）保证胶块在液面下而不在管壁上。
（6）将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
（7）将纯水和TE放在54℃水浴中预热。
5）洗胶块
（1）从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap轻轻倒掉CLB。
（2）毎管中加入15ml预热的纯水。
（3）确保胶块在液面下面不在管壁或盖子上，放回54℃水浴摇床中，摇10分钟。
（4）倒掉水，用纯水再洗一次
（5）倒掉水，加入15ml预热的TE，在54℃的水浴摇床中摇15分钟。
（6）倒掉TE，用TE重复洗三次，时间分别为15分钟，30分钟，30分钟至1小时。
（7）倒掉TE，加入5ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
注意：要确保胶块在液面下面不在管壁或盖子上。
6）胶块内的酶切
（1）准备25℃和37℃水浴。
（2）在1.5ml eppenddorf 管上标记好相应样品的名称。
（3）按照表13-4，配制Smal的稀释缓冲液，混匀。
注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。
13-4
试剂       μl / 胶块 μl /7胶块
纯水          160μl 1120μl
10×T Buffer    20μl 140μl
BSA（0.1%）       20 140
总体积          200μl 1400μl
（4）按照表13-5，配制XbaⅠ的稀释缓冲液。
注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。
13-5
试剂（Promega） μl / 胶块 μl /3胶块
纯水                  178μl 534μl
10×T Buffer             20μl 60μl
BSA（0.1%）             2 6
总体积                   200μl 600μl
（5）在每个1.5ml eppendorf管中加入200μl稀释缓冲液。
（6）把胶块放在干净的培养皿上。
（7）用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中，确保胶块在液面下面，将剩余的胶块放回原来的TE中。
（8）用同样的方法处理标准株H9812的胶块，放入Xba l缓冲液中。
（9）将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
（10）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。
试剂（Promega） μl / 胶块 μl /7胶块
纯水                  155μl 1085μl
10×T Buffer       20μl    140μl
BSA（0.1%）      20 140
SmaⅠ                      5 35
总体积 200μl 600μl

试剂（Promega） μl / 胶块 μl /3胶块
纯水 173μl 519μl
Buffer D 20μl 60μl
BSA（10mg/ml） 2 6
X baⅠ 5 15
总体积 200μl 600μl
(11)孵育完，用移液枪吸出液体，吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。
（12）毎管加入200μl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。
（13）37℃水浴，孵育3~4小时。
7）制备1%胶
（1）称取1g SKG，溶于100ml 0.5×TBE缓冲液中。
（2）微波炉加热约2分钟，每分钟20秒混匀，直至完全溶解。
（3）放在53℃~56℃水浴，5~6分钟。
8）加样
（1）将胶块直接黏贴在梳子齿上
①调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。
②从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
③用枪头吸出酶切混合液，枪头应贴至管底，避免损伤或吸出胶块。
④毎管加入200μl 0.5×TBE，用枪头冲洗胶块。
⑤把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上，若为15个齿的梳子则放在第1、8、15个齿上。
⑥用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。
⑦把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触，从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在53℃~56℃平衡的1%SKG，避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
⑧记录加样顺序。
（2）将胶块直接加在加样孔内
①调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距，用水平仪调整胶槽使其水平。
②把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃~66℃平衡的1%SKG，避免气泡的生成；如果有，用枪头消除，在室温下凝固30分钟左右，小心拔出梳子。
③从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
④用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
⑤毎块胶加入200μl 0.5×TBE平衡。
⑥用小铲将胶块加入加样孔。
⑦用溶化的胶封闭加样孔。
注意：可以在加样孔加入 0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成，并记录加样顺序。
9)电泳
（1）确保电泳槽是水平的，如果不水平，调整槽底部的旋钮，注意：不要触碰电极。
（2）加入2.2L 0.5×TBE，关上盖子。
（3）打开主机和泵的开关，泵设在-70（这时缓冲液的流速约1L/分钟），使缓冲液在管道中循环。
（4）打开冷凝机，预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要15分钟左右）。
（5）打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸消除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。
（6）设置电泳参数。
Initial switch time = 4.0 seconds
Final switch time = 40.0 seconds
14cm宽×13cm长的胶电泳时间为19小时
启动“Start Run”
(7)记录电泳初始电流（通常120-145ma）.
(8)结束电泳：关机顺序为：冷凝机-泵-主机。
10）图像的获取
（1）取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml,1:10,000稀释，即在400ml水中40μl储存液）。
注意：EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用5次。废弃的EB溶液应妥善处理。
（2）将托盘放在摇床上摇20~30分钟。
（3）放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。
（4）带上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能毎20-30分钟换一次纯水。
（5）用Gel Doc 2000拍摄图像。
注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。
（6）转换成﹡1sc文件用于处理分析。
11）图像的读取
电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取，图像需为1BM兼容的未压缩的TIFF格式，且分辨率≥768×640像素。