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怡红痴子

金虫 (小有名气)

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[求助] TA克隆，假阳性？假阴性？已有1人参与

楼主初学TA克隆，经过一翻坎坷之后，终于小有成果，但是最近遇到了一个新的问题。
我是做土壤细菌氨氧化基因的TA克隆，目的片段大概490bp，用的载体试剂盒是TAKARA的pMD18-T，将PCR产物16℃过夜连接后，转入80uL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，LB液体37℃，200rpm摇1h后，离心浓缩至150uL菌液涂板（含100ug/mL氨苄），然后倒置37℃过夜培养（大约12h）。次日共挑取了78个单菌落分别接种到1mL氨苄LB液体培养基中37℃、200rpm培养12h，取1uL菌液进行PCR（采用M13-47和RV-M这对载体通用引物），但是菌液PCR验证结果只有29个阳性克隆，其中有一个还混入了空载体算是废掉了，只剩28个，可是78个只有28个是阳性，这比率也太小了点吧？
其他那49个没P出来的到底是氨苄筛选时的假阳性呢？还是菌液PCR时的假阴性？是不是我哪里没做好，请高人帮我分析一下原因，不胜感激！

PS：我同时做了阳性和阴性对照的，都很正常，阳性随机挑了9个菌落做PCR，验证结果都是阳性的

[ Last edited by 怡红痴子 on 2013-8-7 at 21:29 ]

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1楼 2013-08-07 21:11:32

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怡红痴子

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引用回帖:

12楼: Originally posted by swach at 2014-07-08 18:41:28
楼主，你好，我是刚开始做氨氧化的克隆的，你用的是什么引物以及pcr条件,可以告诉我下吗？我用文献上的引物和条件p出来的是两条条带，谢谢

The PCR amplification of bacterial amoA gene fragments were performed using the primer pair amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) and amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′) (Rotthauwe et al. 1997) under the conditions described by Brown (et al. 2013).