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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ni柱纯化问题
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)

[求助] ni柱纯化问题 已有1人参与

大家好，我最近用金斯瑞的Ni柱纯化我的蛋白（带His6），上样过程会穿过挺多，吸附也较弱（说明书上的缓冲液
Lysis  Equilibration Buffer (LE buffer):   50 mM NaH 2 PO4,   300  mM NaCl, pH  8.0 
Wash  Buffer:    50 mM NaH 2 PO4, 300  mM NaCl, 10 mM imidazole,   pH  8.0 
Elution  buffer:   50 mM NaH 2 PO4, 300  mM  NaCl,  250  mM imidazole, pH 8.0 
就是用10mM咪唑洗杂，我用10mM咪唑基本洗脱了），想问大家，Ni柱有哪些上样方式，可以把柱材和我样品混匀过夜，第二天装柱吗？大家平时还用什么缓冲液效果好，谢谢大家
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1楼 2013-08-06 11:13:16
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929519755

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-14 13:55:28
我用低浓度洗脱就可以将我目的蛋白和杂蛋白一起洗下来，我可以选择梯度洗脱吗，谢谢...

可以啊  告诉你怎么弄
用20mM咪唑漂洗25ml 收集样品，只用收集三管，分别从开始、中间、和结束时收集。
用30mM咪唑漂洗25ml 收集样品，只用收集三管，分别从开始、中间、和结束时收集。
用40mM咪唑漂洗6mL收集样品，这一次把这6ml都分管收集了，每管1ml。
然后拿去跑胶，看看效果。
如果 你的目的蛋白在低浓度就可以洗脱下来的话，那么用40mM咪唑洗脱收集的样品也够了……
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想你没话说
24楼2013-08-15 11:05:15
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鸡鸣不已: 金币+5, ★有帮助, TKS 2013-08-07 20:33:02
NI柱旧了吧， 再生后试了么？
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
2楼2013-08-06 11:19:33
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang1zheng2 at 2013-08-06 11:19:33
NI柱旧了吧， 再生后试了么？

再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢
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3楼2013-08-06 15:23:34
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-06 15:23:34
再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢...

对不起，没试过，只能说：可能吧。
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
4楼2013-08-06 15:30:02
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