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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下

应助: 2 (幼儿园)
金币: 1409.2
散金: 56
红花: 1
帖子: 667
在线: 52.5小时
虫号: 442605
注册: 2007-10-27
专业: 细胞信号转导

[交流] 测序！测序！测不出无信号啊～～！

虫虫们好！直接说问题了：
重组质粒构建，质粒提取，跑个电泳，OK，大小正确；
PCR验证有目的条带，很明显，正确；
双酶切，目的条带很明显，但是载体切不出来。呈现三条带，除目的条带外，另一条×2刚好是载体，重复仍是如此！
（20ul体系：TaKaRa Xho I/ EcoR I 各1ul,质粒4ul ,10*通用buffer 2ul,dH2O 12ul，按说明37度，3h或过夜都试过，结果一样！1%琼脂糖凝胶 TAE电泳液）

后来不管了，测序去！一次送质粒，二次仍质粒，不同测序公司都没有信号啊！（自己提的质粒浓度检验还是不错的，酶切也用同样的质粒啊）；再后来换菌液测序，仍无信号！

故事搁浅，目前结局很郁闷啊！虫虫帮提提建议～

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——穿越死亡之门，到我这里来，虽则梦想褪色，岁月集成的果实腐烂掉，但我是永恒的真理，你将再会见我，在你从此岸渡向彼岸的生命航程中...

1楼 2007-11-06 16:22:35

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rocky_5555

应助: (幼儿园)
在线:
虫号: 422225

★ ★
johnsooh(金币+2,VIP+0):thx

会不会是质粒载体的问提呢?
1,在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败.
2,双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。

3,第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR产物回收试剂盒纯化酶切样保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管，将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O,离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf管上，离心，即可将DNA片段离下来，做下一次酶切。
4,设立对照：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照。
5,拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下。

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。