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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhoutianhe at 2013-07-30 11:35:43
负对照??用的是1微升的菌液...

负对照就是用其他菌为模板或者直接用水为模板P,看PCR系统是否有污染。我觉得筛选直接用菌落PCR就很方便,为什么要摇菌做菌液PCR?
11楼2013-07-30 23:17:22
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tmaclhf

铁虫 (小有名气)


建议你把质粒提出来做个PCR就好了~菌液PCR是会出现假阳性的·
12楼2013-07-31 09:00:55
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议用载体上的通用引物扩增,然后提质粒双酶切鉴定,另外,在提交测序单子时可以注明存在高级结构,应该能测出来
13楼2013-07-31 09:17:19
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一树春天

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by wodehao110 at 2013-07-30 22:41:53
会不会pcr温度太低了,导致非特异条带多。

非特异性条带应该是退货温度太低的原因
14楼2013-08-01 14:28:48
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一树春天

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
实在不行你提个质粒 跑胶看大小 确定是不是连上了
15楼2013-08-01 14:31:06
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zhoutianhe

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by yuanbo934 at 2013-07-31 09:17:19
建议用载体上的通用引物扩增,然后提质粒双酶切鉴定,另外,在提交测序单子时可以注明存在高级结构,应该能测出来

以前直接pcr的测序说有高级结构无法测,难道克隆过后就能测出来??、
16楼2013-08-03 18:59:34
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhoutianhe at 2013-07-30 10:10:53
没有我要的条带,我回收之前的条带,如图,当时我的退火温度是62.3,但是克隆过后用62.3什么都没有p出来,然后用的50度,就是之前这种多条带了,引物都是用一样的引物

JE_$3W$}3YR$B0N)EO7J)CB.jpg
...

之前PCR用的温度能出来的话,换了模板也任然能够P出来,没必要换温度。下次做菌液的时候试试将菌液离心沉淀,然后用水重悬,以出去LB培养基试试看,有些公司的LB成分对PCR影响蛮大。同时做个minpre,将质粒提出来后,用质粒做模板进行PCR,同时做个酶切,double check 一下,一般都不会有问题的,Good luck!
互助互励,共奋共进!!
17楼2013-08-03 20:41:18
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