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关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人
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最近我一直在做Gateway入门载体BP反应。发现一些问题。 1.BP反应前需要设计一段加接头的基因特异性引物做全长基因pcr扩增，接头序列让我很捉摸不透。师兄告诉我 上游引物前附加：5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA 下游引物前附加：5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA 可是我发现这跟官方说明书Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一样，我是菜鸟，真的不明白怎么回事，这对后面的BP反应有影响吗。 2.这两天做了BP反应连接转化，挑斑（过夜连接，每个平板大约10几20个斑，很少），然后菌落PCR（M13引物）发现5个基因的电泳条带基本上完全一致，700-800bp左右，而我的5个基因应该是1500bp左右，我捉摸着是不是都是空载体。会不会是都没连接上，也不知道是哪出了问题，用高保真酶扩基因全长条带都很单一也是目的片段，就是不知道为什么会这样，各位大侠牛人教教小女子吧！！ |
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我的BP反应用的是PDONR221，浓度200ng左右，抗性应该没错都是抗卡那的。昨天测序结果出来了，虽然斑长得很少，但确实有目的片段已经连上载体了，还算庆幸。还有就是刚才大侠说的BP作用位点是什么呢，我看gateway的说明书也不太明白，有的师兄告诉我，我的引物结头不一样是没有关系的说什么gateway载体版本的问题，我都晕了，本来就不太懂的 |
benita199519楼2013-07-25 10:22:58
13楼2013-07-22 08:34:45