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关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人
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最近我一直在做Gateway入门载体BP反应。发现一些问题。 1.BP反应前需要设计一段加接头的基因特异性引物做全长基因pcr扩增,接头序列让我很捉摸不透。师兄告诉我 上游引物前附加:5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA 下游引物前附加:5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA 可是我发现这跟官方说明书Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一样,我是菜鸟,真的不明白怎么回事,这对后面的BP反应有影响吗。 2.这两天做了BP反应连接转化,挑斑(过夜连接,每个平板大约10几20个斑,很少),然后菌落PCR(M13引物)发现5个基因的电泳条带基本上完全一致,700-800bp左右,而我的5个基因应该是1500bp左右,我捉摸着是不是都是空载体。会不会是都没连接上,也不知道是哪出了问题,用高保真酶扩基因全长条带都很单一也是目的片段,就是不知道为什么会这样,各位大侠牛人教教小女子吧!! |
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我的BP反应用的是PDONR221,浓度200ng左右,抗性应该没错都是抗卡那的。昨天测序结果出来了,虽然斑长得很少,但确实有目的片段已经连上载体了,还算庆幸。还有就是刚才大侠说的BP作用位点是什么呢,我看gateway的说明书也不太明白,有的师兄告诉我,我的引物结头不一样是没有关系的说什么gateway载体版本的问题,我都晕了,本来就不太懂的 |
19楼2013-07-25 10:22:58
13楼2013-07-22 08:34:45













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benita1995