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zhenglingyu

铜虫 (初入文坛)


[交流] 关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人

最近我一直在做Gateway入门载体BP反应。发现一些问题。
1.BP反应前需要设计一段加接头的基因特异性引物做全长基因pcr扩增,接头序列让我很捉摸不透。师兄告诉我
上游引物前附加:5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA
下游引物前附加:5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA
可是我发现这跟官方说明书Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一样,我是菜鸟,真的不明白怎么回事,这对后面的BP反应有影响吗。
2.这两天做了BP反应连接转化,挑斑(过夜连接,每个平板大约10几20个斑,很少),然后菌落PCR(M13引物)发现5个基因的电泳条带基本上完全一致,700-800bp左右,而我的5个基因应该是1500bp左右,我捉摸着是不是都是空载体。会不会是都没连接上,也不知道是哪出了问题,用高保真酶扩基因全长条带都很单一也是目的片段,就是不知道为什么会这样,各位大侠牛人教教小女子吧!!
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zhenglingyu

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
15楼: Originally posted by starseacow at 2013-07-22 18:07:46
我用的是
attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

但楼主的引物没什么问题,有完整的BP作用位点。对于正常BP反应,如果你的感受态细胞没有问题,可以长出成百上千个菌落,只 ...

我的BP反应用的是PDONR221,浓度200ng左右,抗性应该没错都是抗卡那的。昨天测序结果出来了,虽然斑长得很少,但确实有目的片段已经连上载体了,还算庆幸。还有就是刚才大侠说的BP作用位点是什么呢,我看gateway的说明书也不太明白,有的师兄告诉我,我的引物结头不一样是没有关系的说什么gateway载体版本的问题,我都晕了,本来就不太懂的

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19楼2013-07-25 10:22:58
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Sthunder

木虫 (正式写手)



zhenglingyu(金币+1): 谢谢参与
首先,你所用的引物与我所用的有所出入,我用的是:
F   5’  GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC
R  5’  GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT C
其次,BP不是连接哈,他是转换,无论BP OR LR对其浓度要求比较高,请严格按照其说明书要求进行,尤其是BP中的PCR产物浓度,LR中的pZeo浓度。
针对你的情况,建议做个酶切验证,挑取BP产物单克隆,提个质粒,然后用Mlu I 做个酶切看看。

Good luck!
13楼2013-07-22 08:34:45
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