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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人
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zhenglingyu

铜虫 (初入文坛)

[交流] 关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人

最近我一直在做Gateway入门载体BP反应。发现一些问题。
1.BP反应前需要设计一段加接头的基因特异性引物做全长基因pcr扩增，接头序列让我很捉摸不透。师兄告诉我
上游引物前附加：5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA
下游引物前附加：5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA
可是我发现这跟官方说明书Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一样，我是菜鸟，真的不明白怎么回事，这对后面的BP反应有影响吗。
2.这两天做了BP反应连接转化，挑斑（过夜连接，每个平板大约10几20个斑，很少），然后菌落PCR（M13引物）发现5个基因的电泳条带基本上完全一致，700-800bp左右，而我的5个基因应该是1500bp左右，我捉摸着是不是都是空载体。会不会是都没连接上，也不知道是哪出了问题，用高保真酶扩基因全长条带都很单一也是目的片段，就是不知道为什么会这样，各位大侠牛人教教小女子吧！！
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1楼 2013-07-21 16:49:02
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zhenglingyu

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by starseacow at 2013-07-22 18:07:46
我用的是
attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

但楼主的引物没什么问题，有完整的BP作用位点。对于正常BP反应，如果你的感受态细胞没有问题，可以长出成百上千个菌落，只 ...

我的BP反应用的是PDONR221，浓度200ng左右，抗性应该没错都是抗卡那的。昨天测序结果出来了，虽然斑长得很少，但确实有目的片段已经连上载体了，还算庆幸。还有就是刚才大侠说的BP作用位点是什么呢，我看gateway的说明书也不太明白，有的师兄告诉我，我的引物结头不一样是没有关系的说什么gateway载体版本的问题，我都晕了，本来就不太懂的
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benita1995
19楼2013-07-25 10:22:58
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Sthunder

木虫 (正式写手)
★
zhenglingyu(金币+1): 谢谢参与
首先，你所用的引物与我所用的有所出入，我用的是：
F   5’  GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC
R  5’  GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT C
其次，BP不是连接哈，他是转换，无论BP OR LR对其浓度要求比较高，请严格按照其说明书要求进行，尤其是BP中的PCR产物浓度，LR中的pZeo浓度。
针对你的情况，建议做个酶切验证，挑取BP产物单克隆，提个质粒，然后用Mlu I 做个酶切看看。

Good luck！
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13楼2013-07-22 08:34:45
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