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从麻风果果仁中提取粗蛋白的实验
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1 称取500 g 麻疯果果仁研碎放于2000 mL 锥形瓶，加入1000 mL PBS缓冲液浸渍放于恒温震荡器4 ℃以转速200 rpm提取24小时。后取出以纱布粗过滤得滤液，再将滤液放于高速冷冻离心机以4 ℃、16000 rpm离心20分钟，取上清液合并，弃去沉淀。上清液使用 密理博超滤机 超滤除去小分子杂质得到浓缩大分子总提物 2用盐析提纯 配95%饱和的硫酸铵溶液，将0.05 M 的pH=9.0的Tris-HCl缓冲液加入到浓缩蛋白粗提液并调节其浓度，使得蛋白质浓度大约为25~30 mg/mL，( 怎么可以观察到蛋白质的浓度以便调节？)使用氨水调节pH=9.0。逐步滴加95%饱和硫酸铵溶液，并不断搅拌，至饱和，样品放于4 ℃冷却3小时后，以12000 rpm 离心20分钟，取上清液继续滴加硫酸铵至不再生成沉淀，倒上清液，用Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，得含盐蛋白质溶液 3层析脱盐 凝胶预处理：在室温下，将Sephadex G-75干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干，放于无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后再用0.2 mol/L HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性。上柱，用Tris-HCl缓冲液冲洗柱床，加将含盐蛋白质溶液缓慢沿壁加入到柱中，待样品将要低于凝胶面时再滴加缓冲液，到液面高度超过5 cm时，可以继续用缓冲液冲洗柱子。以小流速冲洗0.5 mL/min，收集既得蛋白质样品溶液。 以上步骤就可以得到粗蛋白了？？求高手修改，指导。 |
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本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 实验方案.doc
2013-07-19 17:30:48, 12 K
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