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pjy284548878

新虫 (小有名气)

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[交流] 从麻风果果仁中提取粗蛋白的实验

1 称取500 g 麻疯果果仁研碎放于2000 mL 锥形瓶，加入1000 mL PBS缓冲液浸渍放于恒温震荡器4 ℃以转速200 rpm提取24小时。后取出以纱布粗过滤得滤液，再将滤液放于高速冷冻离心机以4 ℃、16000 rpm离心20分钟，取上清液合并，弃去沉淀。上清液使用密理博超滤机超滤除去小分子杂质得到浓缩大分子总提物

2用盐析提纯配95%饱和的硫酸铵溶液，将0.05 M 的pH=9.0的Tris-HCl缓冲液加入到浓缩蛋白粗提液并调节其浓度，使得蛋白质浓度大约为25~30 mg/mL，( 怎么可以观察到蛋白质的浓度以便调节？)使用氨水调节pH=9.0。逐步滴加95%饱和硫酸铵溶液，并不断搅拌，至饱和，样品放于4 ℃冷却3小时后，以12000 rpm 离心20分钟，取上清液继续滴加硫酸铵至不再生成沉淀，倒上清液，用Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，得含盐蛋白质溶液

3层析脱盐凝胶预处理：在室温下，将Sephadex G-75干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干，放于无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后再用0.2 mol/L HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性。上柱，用Tris-HCl缓冲液冲洗柱床，加将含盐蛋白质溶液缓慢沿壁加入到柱中，待样品将要低于凝胶面时再滴加缓冲液，到液面高度超过5 cm时，可以继续用缓冲液冲洗柱子。以小流速冲洗0.5 mL/min，收集既得蛋白质样品溶液。

以上步骤就可以得到粗蛋白了？？求高手修改，指导。

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附件 1 : 实验方案.doc

2013-07-19 17:30:48, 12 K

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1楼 2013-07-19 17:30:57

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