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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物非特异性条带的去除
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jkamm

金虫 (正式写手)
看你的图，似乎是目的条带哦，跑的好呢，你目的带片断多大？
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11楼2013-07-16 11:20:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王芳边疆: 金币+5, ★有帮助 2013-07-17 17:57:15
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。
二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。
三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（4）重新提取模板DNA。
2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。
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12楼2013-07-16 11:25:42
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kapa1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再优化反应条件吧 提高退火温度 或者选更合适的引物 还不行的话就切胶回收吧 但是我之前做胶回收感觉回收效率挺低的  最好还是能优化条件
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13楼2013-07-17 16:59:47
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Be_Abuse

新虫 (初入文坛)
建议跑开后切胶！
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14楼2014-01-17 10:53:05
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
建议采用热启动DNA Polymerase，大量的非特异扩增都会消失
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rainwater
15楼2014-01-17 12:57:35
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