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王芳边疆

金虫 (正式写手)

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[求助] PCR产物非特异性条带的去除

PCR产物出现少量的非特异性条带，该条带与特异性条带间隔很近，使用PCR产物纯化试剂盒好还是割胶回收试剂盒好呢？
由图可以看出，F200、H200在240bp处拥有浓度很大的特异性条带，然而在其上方微弱的看到些条带，由于PCR条件摸索多次不能成功，预采用PCR产物纯化试剂盒或者胶回收试剂盒，可是初来乍到，对方法的选取有些迷茫，请各位前辈给予帮助

FGHK240bp PCR产物 2013-07-14 20 小时 29 分钟_副本.jpg

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温暖定格

1楼2013-07-14 20:56:34

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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王芳边疆: 金币+5, ★有帮助 2013-07-17 17:57:15

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
一．引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。
二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度。
三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（4）重新提取模板DNA。
2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。