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cathystar

铁虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

本人之前用Ni柱纯化His标签蛋白,可以挂柱,挂柱效果还可以,但是目前树脂颜色变为浅灰色,我就按照说明进行了重生,重生完了结果蛋白无法挂柱了,想请问各位这是怎么回事。
而且我摇菌的时候,加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了,然后第二天又浑了。这又是怎么回事哦。之前都没有出现过。
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cathystar

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by happylst at 2013-07-13 21:37:22
柱子变色应该是柱子失去柱效了,蛋白当然挂不上!你的蛋白前期没有预处理!最好前期先粗纯化一次!菌体加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了,然后第二天又浑了应该是你加的诱导剂浓度有点大

可是我小量诱导的时候就不变清,换成大量诱导就变清
6楼2013-07-18 22:25:02
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happylst

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助! 2013-07-18 16:45:09
柱子变色应该是柱子失去柱效了,蛋白当然挂不上!你的蛋白前期没有预处理!最好前期先粗纯化一次!菌体加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了,然后第二天又浑了应该是你加的诱导剂浓度有点大
紫龙
2楼2013-07-13 21:37:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
蛋白挂不上柱是柱子重生失败。你确定操作没有问题?诱导问题可能是IPTG的用量错误。
3楼2013-07-14 00:33:17
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, good! 2013-07-18 16:45:21
柱子重生要看好操作说明,尤其是重生buffer,要确定没有配错
你说的菌体变少的情况,我也有遇到。
①可能是IPTG染了噬菌体等杂质,摇瓶变清,之后长得是别东西,可以镜检看看。
②IPTG用量为0.1mM~1mM,用多了对细胞有毒性伤害,涨不起来。
手握日月摘星辰,看透生死破凡尘
4楼2013-07-14 15:08:38
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