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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白纯化
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cathystar

铁虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

本人之前用Ni柱纯化His标签蛋白，可以挂柱，挂柱效果还可以，但是目前树脂颜色变为浅灰色，我就按照说明进行了重生，重生完了结果蛋白无法挂柱了，想请问各位这是怎么回事。
而且我摇菌的时候，加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了，然后第二天又浑了。这又是怎么回事哦。之前都没有出现过。
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1楼 2013-07-13 17:37:24
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happylst

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-18 16:45:09
柱子变色应该是柱子失去柱效了，蛋白当然挂不上！你的蛋白前期没有预处理！最好前期先粗纯化一次！菌体加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了，然后第二天又浑了应该是你加的诱导剂浓度有点大
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紫龙
2楼2013-07-13 21:37:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白挂不上柱是柱子重生失败。你确定操作没有问题？诱导问题可能是IPTG的用量错误。
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3楼2013-07-14 00:33:17
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-07-18 16:45:21
柱子重生要看好操作说明，尤其是重生buffer，要确定没有配错
你说的菌体变少的情况，我也有遇到。
①可能是IPTG染了噬菌体等杂质，摇瓶变清，之后长得是别东西，可以镜检看看。
②IPTG用量为0.1mM~1mM，用多了对细胞有毒性伤害，涨不起来。
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
4楼2013-07-14 15:08:38
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xiaomingj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

柱子重生要看好操作说明，尤其是重生buffer，要确定没有配错

①可能是IPTG染了噬菌体等杂质，摇瓶变清，之后长得是别东西，可以镜检看看。
②IPTG用量为0.1mM~1mM，用多了对细胞有毒性伤害，涨不起来。
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5楼2013-07-18 15:05:28
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cathystar

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happylst at 2013-07-13 21:37:22
柱子变色应该是柱子失去柱效了，蛋白当然挂不上！你的蛋白前期没有预处理！最好前期先粗纯化一次！菌体加入IPTG之前OD为0.6然后要几个小时之后就变清了，然后第二天又浑了应该是你加的诱导剂浓度有点大

可是我小量诱导的时候就不变清，换成大量诱导就变清
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6楼2013-07-18 22:25:02
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