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guomimi新虫 (小有名气)
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[求助]
PCR问题
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| 模板取1.5ul,822bp.实验中PCR温度是58-63摄氏度，但是电泳后结果不仅有杂带而且带都大于1000bp了，这是怎么回事呢？应该怎么得到想要的带呢？ |
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 核酸生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
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PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下： 一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。 二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。 三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。 这种非特异性带出现可用以下方法解决： （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。 对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 相关的问题，我过去回答过，但是这次的回答做了补充和修改。 |
8楼2013-07-12 00:02:33
yb19841014
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2楼2013-07-11 19:28:03
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3楼2013-07-11 19:47:12
武穆大成
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4楼2013-07-11 20:18:50
