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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RNA提取的几个问题~~~
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sstefsun0630

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by grape_vine at 2013-07-09 15:25:20
天根的试剂盒,出问题比较多的有两个地方,一个是裂解液,还有一个是酚.如果裂解液你每次都是整瓶加热的话,可能用了几次以后,再用效果就不好了.另外就是那瓶酚,有的时候他们的饱和酚感觉上面的水封做的不好,用着用着就 ...

加裂解液后我都没有加热过，都是剧烈摇晃然后就直接离心了。实验室的其他同学都是这么做的，也没有出现我这个问题~唉~~我这个试剂盒没有酚。
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11楼2013-07-09 21:51:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by sstefsun0630 at 2013-07-09 15:07:20
我的植物还是比较年轻的小苗~~~前几天有一次我提的RNA不论是A260/280还是电泳都特别好（取样品量和以前没什么区别）。跟以前唯一不同的是漂洗液是现用现配的，不知道跟这个有关系没有~不过这几次又恢复老样子了。愁 ...

有时候也可能是试剂盒的问题。你是否注意到有试剂过期变质？
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12楼2013-07-10 00:49:18
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jinqimaggie

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑在第一次bind柱子时加入等体积的异丙醇提高提取浓度 蛋白质污染，主要还是要照kit上的量加，比如如果你的Rna比较短，要加5-6体积的binding solution（第一步）
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13楼2013-07-10 05:06:18
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sstefsun0630: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-12 14:31:17
1、先说产量 。产量降低你是否能确保每次所用的起始材料一样以及新鲜、老嫩程度一样？否则，批间操作出现差异应该很正常。更重要的是质量。
2、260/280。如果不是OD不准确的话，1.5的比值可能是有蛋白污染（“可能”）。(楼主说的点样孔亮那种情况可能是蛋白残留太多，有时候可能残留不多就不一定看得见点样孔亮了。)是用什么仪器测的OD值？260读数多少？原液测的还是稀释几倍测的？
楼上说的OD值与电泳的对比是指根据OD测出的量上样电泳，其亮度跟预期（OD）是否吻合。这需要经验。
祝实验顺利。
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伟大航线....
14楼2013-07-10 10:00:46
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提rna，尤其是用来构建文库的RNA，最好不要用试剂盒。因为试剂盒是吸附柱，柱子吸附有选择性。所以这样的rna不完全，而且一些大的rna也可能吸附不上，建议用trizol。。按着trizol的说明书做，应该可以提的很好。。提了N多次，都很好。
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15楼2013-07-10 11:14:31
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silentyang2

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
A260/280偏低一般是蛋白杂质污染造成的。一般用盒子提主要注意提取样品的生物量不宜太多或者太少，否则影响破碎效果和纯度。提植物的RNA不要用太老的样品。
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16楼2013-07-10 11:44:48
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sstefsun0630

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-07-10 05:06:18
可以考虑在第一次bind柱子时加入等体积的异丙醇提高提取浓度 蛋白质污染，主要还是要照kit上的量加，比如如果你的Rna比较短，要加5-6体积的binding solution（第一步）

我用的这个Kit，第一次吸附的时候是要吸取400 uL裂解的样品+200 uL无水乙醇。这样要是再加等体积的异丙醇管子盛不下~~~
我们第一步的吸附加的就是无水乙醇~~~说明书上是让加0.5倍体积的。可能跟你那个不太一样~~
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17楼2013-07-10 13:21:59
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sstefsun0630

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by longrna at 2013-07-10 10:00:46
1、先说产量 。产量降低你是否能确保每次所用的起始材料一样以及新鲜、老嫩程度一样？否则，批间操作出现差异应该很正常。更重要的是质量。
2、260/280。如果不是OD不准确的话，1.5的比值可能是有蛋白污染（“可能 ...

1.我的植物是一年生的草本，我开始取样的时候是长了三个月左右，之后每次是隔一周去一次，应该差别不大的吧~
2.我用的是微量分光光度计，每次取2 uL检测。260的度数大概在2.6左右。用的是原液测的~
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18楼2013-07-10 14:03:56
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sstefsun0630

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-10 00:49:18
有时候也可能是试剂盒的问题。你是否注意到有试剂过期变质？...

我用新的试剂盒也会出现这样的情况。别人即使在我之后提也比我这个好一点~~~让他们看我操作什么的也没发现有什么问题~~~所以很惆怅~
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19楼2013-07-10 14:05:38
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sstefsun0630

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-07-10 11:14:31
提rna，尤其是用来构建文库的RNA，最好不要用试剂盒。因为试剂盒是吸附柱，柱子吸附有选择性。所以这样的rna不完全，而且一些大的rna也可能吸附不上，建议用trizol。。按着trizol的说明书做，应该可以提的很好。。提 ...

我这个是要用来做Q-PCR的，我有一次找同学帮我提取了一下我的样品（用一样的东西），结果他提出来260/280有2.1，含量也有160 ng/uL。
像我提出来的这样质量的RNA做Q-PCR应该还可以用的吧？
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20楼2013-07-10 14:10:32
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