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[资源] Evolutionary Methods in Biotechnology

Evolutionary Methods in Biotechnology
——Clever Tricks for Directed Evolution
Edited by Susanne Brakmann and Andreas Schwienhorst

Evolutionary Methods in Biotechnology.jpg

Contents
1 Introduction
Susanne Brakmann and Andreas Schwienhorst . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2 Generation of Mutant Libraries Using Random Mutagenesis
Susanne Brakmann and Björn F. Lindemann . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.1 Materials for Random PCR Mutagenesis . . . . . . . . . . 6
2.2.2 Materials for Mutator Strain Passage . . . . . . . . . . . . 6
2.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1 Protocol for Random PCR Mutagenesis According to Joyce 7
2.3.2 Protocol for Mutator Strain Passage . . . . . . . . . . . . 8
2.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3 DNA Shuffling
Hikaru Suenaga, Masatoshi Goto, and Kensuke Furukawa . . . . . . . . . . 13
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.1 For Preparation of Parental Genes . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.2 For Random Fragmentation by DNase I . . . . . . . . . . 15
3.2.3 For Collection of DNA Fragments
in Specific Molecular Size Ranges . . . . . . . . . . . . . 16
3.2.4 For Reassembly of These Fragments by Primerless PCR . 16
3.2.5 For Amplification of Reassembled Products
by Conventional PCR with Primers . . . . . . . . . . . . . 16
3.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.1 Preparation of Parental Genes . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.2 Random Fragmentation by DNase I . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.3 Collection of DNA Fragments
in Specific Molecular Size Ranges . . . . . . . . . . . . . 18
3.3.4 Reassembly of These Fragments by Primerless PCR . . . 19
3.3.5 Amplification of Reassembled Products
by Conventional PCR with Primers . . . . . . . . . . . . . 20
3.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.4.1 Insufficient DNase I Fragmentation . . . . . . . . . . . . . 21
3.4.2 Little or No Product of Primerless PCR . . . . . . . . . . 21
3.4.3 Little or No Product of PCR with Primers . . . . . . . . . 21
3.4.4 The Product of PCR with Primers is Multi-banded . . . . 22
3.5 Amplification Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4 DNA Recombination Using StEP
Milena Ninkovic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2.1 StEP PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2.2 Purification of an Appropriate DNA Fragment . . . . . . 27
4.2.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.4 Technical Tips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.4.1 Problem: Little or No PCR Product
(Full-length Product) after PCR . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.4.2 Problem: High Background Levels of DNA after PCR . . 28
4.5 StEP in Directed Evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5 FACS Screening of Combinatorial Peptide and Protein Libraries
Displayed on the Surface of Escherichia coli Cells
Thorsten M. Adams, Hans-Ulrich Schmoldt, and Harald Kolmar . . . . . . . 31
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.2.1 Escherichia coli Strains and Plasmids . . . . . . . . . . . 35
5.2.2 Liquid Media and Agar Plates . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.2.3 Biological and Chemical Materials . . . . . . . . . . . . . 36
5.2.4 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3.1 Verification of Cell Surface Exposure
of the Passenger Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3.2 Labeling of the Target Protein . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.3 Library Construction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.4 Combinatorial Library Screening by FACS and MACS . . 40
5.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6 Selection of Phage-displayed Enzymes
Patrice Soumillion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
6.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
6.2.1 Buffers, Reagents and Consumables . . . . . . . . . . . . 50
6.2.2 Strains and Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
6.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6.3.1 The Phage-enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6.3.2 Library Construction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6.3.3 Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
6.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.4.1 Phage Titers Are Not Reproducible . . . . . . . . . . . . . 62
6.4.2 Phage-enzymes Degrade with Time . . . . . . . . . . . . . 63
6.4.3 Phages Are Not Genetically Stable . . . . . . . . . . . . . 63
6.4.4 The ‘out/in’ Ratio Does Not Increase with Selection Rounds 63
6.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
7 Selection of Aptamers
Heiko Fickert, Heike Betat, and Ulrich Hahn . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2.1 Immobilization of Target Molecules . . . . . . . . . . . . 66
7.2.2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.3 In vitro Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.4 RNA Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.5 Selection of Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.6 Reverse Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3.1 Selection of RNA Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.3.2 Selection of 2-Modified RNA Aptamers . . . . . . . . . . 75
7.3.3 Selection of ssDNA Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 76
7.3.4 Cloning and Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.3.5 Characterization of Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.3.6 Example: Isolation of Moenomycin A-specific Aptamers 79
7.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
8 Methods for Selecting Catalytic Nucleic Acids
Benjamin L. Holley, and Bruce E. Eaton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
8.2 Materials and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
8.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.3.1 Generating the Starting Library . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.3.2 Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
8.3.3 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
8.3.4 Nucleic Acid-catalyzed Reactions . . . . . . . . . . . . . . 102
8.3.5 Reverse Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
8.3.6 Partitioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
8.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
8.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
9 High-throughput Screening
of Enantioselective Industrial Biocatalysts
Manfred T. Reetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
9.2 Materials and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
9.2.1 Assays Based on Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . 115
9.2.2 Assays Based on NMR Spectrometry . . . . . . . . . . . . 116
9.2.3 Assay Based on FTIR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 116
9.2.4 Assays Based on UV/Visible Spectroscopy . . . . . . . . 116
9.2.5 Enzyme-coupled UV/Visible-based Assay for Hydrolases 117
9.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
9.3.1 Assays Based on Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . 117
9.3.2 Assays Based on NMR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 121
9.3.3 Assay Based on FTIR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 125
9.3.4 Assays Based on UV/Visible Spectroscopy . . . . . . . . 129
9.3.5 Enzyme-coupled UV/Visible-based Assay for Hydrolases 132
9.3.6 Further Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
9.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
9.4.1 Comments on the Kazlauskas Test . . . . . . . . . . . . . 138
9.4.2 Potential Problems when Performing Kinetic Resolution . 138
9.5 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
10 Computer-assisted Design of Doped Libraries
Dirk Tomandl and Andreas Schwienhorst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
10.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
10.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
10.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
10.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
11 Directed in silico Mutagenesis
Markus Wiederstein, Peter Lackner, Ferry Kienberger, Manfred J. Sippl . . . 153
11.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
11.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
11.2.1 PDB Files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
11.2.2 Knowledge-based Potentials . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
11.2.3 Polyprotein, Z-scores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
11.2.4 In silico Mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
11.2.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.3.1 ProSa Setup and Interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.3.2 ProSa Objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
11.3.3 Session 1 (mut script1.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 164
11.3.4 Session 2 (mut script2.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 166
11.3.5 Session 3 (mut script3.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 168
11.3.6 Session 4 (mut script4.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 170
11.3.7 Tips & Tricks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
11.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
11.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
12 RNA Folding in silico
Christoph Flamm, Ivo L. Hofacker, Peter F. Stadler . . . . . . . . . . . . . . 177
12.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
12.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
12.2.1 Typographical Conventions . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
12.2.2 RNA Web Services . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
12.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
12.3.1 Secondary Structures for Individual Sequences . . . . . . 181
12.3.2 Consensus Structures of a Sample of Sequences . . . . . . 183
12.3.3 Sequence Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
12.3.4 Analysis of SELEX Experiments . . . . . . . . . . . . . . 186
12.3.5 A Note for the Experts: Write your Own RNA Programs . 187
12.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
12.5 Caveats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
13 Patenting in Evolutionary Biotechnology
Martina Leimkühler and Hans-Wilhelm Meyers . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.2 The Nature of Patents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
13.3 What Can Be Patented . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
13.4 The Requirement of Novelty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
13.5 The Requirement of Inventiveness . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
13.6 The Requirement of Utility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
13.7 The Requirements of Enablement and Written Description . . . . 197
13.8 Patent Prosecution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
13.9 Search Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
13.10 The First-to-invent Principle of the United States
and Its Consequences on Laboratory Notebook Keeping . . . . . 206
13.11 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Subject Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211