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凝霜枫叶

银虫 (小有名气)

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[求助] 蓝藻DNA提取，液氮研磨

虫友们，请问有木有用液氮研磨提取蓝藻DNA的呀？我之前没用过液氮研磨，也没见过别人怎么用液氮研磨的，周围也没有做植物的，就想跟大家请教一下用液氮研磨的注意事项，1：是不是一加进液氮就开始研磨（我发现研磨的时候会溅出来液氮）？研磨的时候用多大的力度？是沿着研钵的外围研磨吗？2：研磨之后不知道为什么我的样品不是干粉状，反而有些潮湿，不太好转；，3：还有就是研磨之后是直接把裂解液加到研钵中还是转移之后再加？只研磨了两次，很多经验还木有，望各位虫友尤其是同样提蓝藻DNA的不吝赐教呀，因为样品比较少，所以不敢浪费，急急急……

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1楼2013-06-27 16:29:14

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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引用回帖:

15楼: Originally posted by 凝霜枫叶 at 2013-07-02 08:51:33
那你实验室的protocol和酶学老方法都方便告诉我吗？真心感谢呀，

，我的邮箱jiaoshujing1988@163.com，方便的话请发给我吧，

...

我用的方法：
1. Scratch a loop of cells from a plate and resuspend cells into 0.5 ml of isolation buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl)
2. Add 10 μg DNase-free RNase
3. Add same volume of phenol, heat at 65°C for 5-10 min, mix 2-3 times in between
4. Extract 2 x with phenol:chloroform (1:1) and once with chloroform:amyalcohol (24:1), invert tubes gently by now and then for 5 min
5. Add 1 µg RNase, RT for 30 min
6. Add 1/10V 3M sodium acetate pH5.2, and 2V cold ethanol, store at -20 °C 2h or over night
7. Collect DNA at 14 000 g for 15 min, wash the pellet with 70 % ethanol.
8. Dissolve pellet into 100 µl of TE/water/ 5 mM Tris-HCl pH 8.
所得DNA的浓度大致为几百ng/μl，取0.5-1μl为模板做PCR即可。

酶学方法167卷的方法见附件：