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lxyyzz

木虫 (小有名气)

[求助] 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆! 已有1人参与

分子克隆两个酶切位点是AgeI和XhoI,酶切6h后回收。
载体跑胶,看到的切割条带和预想的一样,8000bp和2000bp,选取8000bp的条带切胶回收。载体和片段回收后也跑过胶,大小位置都是对的。做了好几次都没有阳性克隆,长出的克隆都没有插入片段。

后来我只取了回收后的载体,同样加入连接酶连接转化后,发现板上也长了克隆!大概十几个左右的样子。我很不理解,按照道理说回收后的载体是线性的,并带有两个不同的粘性末端,应该不会再成环啊,为什么还能长的出克隆呢?

请高人帮忙解释下,给点建议!我是真不知道这种情况该怎么办了。
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后悔无期

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-07-10 11:10:51
质粒的构建,要特别注意几个问题。载体和插入片段的mol比。一般是1:10.载体一般0.03pmol,插入片段0.3pmol。。mol数不会算可以再和我交流

请问摩尔数该怎么换算呀!
别回忆,因为回不去。把眼泪留给最疼你的人,把微笑留给伤你最深的人。
12楼2013-07-11 08:15:04
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zhsha1993

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lxyyzz: 金币+5, 有帮助, 就是酶切后用试剂盒回收,然后跑胶看看回收的片段大小对不对。。 2013-07-10 22:51:18
“载体和片段回收后也跑过胶” 这句话如何解?
2楼2013-07-10 09:59:14
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zhsha1993

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你最好把你的质粒图谱发来看看。
3楼2013-07-10 10:07:24
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励新虫交流 2013-07-10 10:10:09
lxyyzz: 金币+5, 有帮助, 线性的两端粘性末端都不一样啊,这样也能自连? 2013-07-10 22:52:16
你所不理解的很正常:线性它也可能再重新自连的哇。
没有阳性克隆,载体上没有插入的片段那可能就是是你连接效率低,长出来的克隆都是自连的。
你看蓝白斑筛选的时候不是一样会长很多非阳性克隆么。
伟大航线....
4楼2013-07-10 10:09:05
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