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求助-两道分子生物学习题答案
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1 已知膜蛋白A和信号蛋白Src存在直接相互作用，物质B和蛋白A结合后， 可诱发Src磷酸化活化，设计至少6个以上分子生物学实验，证实上述发现。 2 蛋白A是一种分泌蛋白，分子量10kd，等电点4.0，基因克隆中加入HisTag 后，克隆到pET21质粒中，用大肠杆菌表达，设计分离方法，将蛋白A纯化。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-19 at 07:01 ] |
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2楼2013-06-18 22:00:56
1949stone
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3楼2013-06-19 07:00:25
lxj341401
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【答案】应助回帖
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我来回答第二道： 蛋白A是一种分泌蛋白是个陷阱，克隆到pET21质粒中，用大肠杆菌表达后应该不能分泌表达，pET21是个胞内表达载体，因为基因克隆中加入了HisTag，所以可以用Ni-NTA柱亲和纯化得到目的蛋白。具体方法如下：工程菌诱导表达后，收集菌体，细胞破碎，离心去沉淀，上清上样于平衡好的Ni-NTA柱，然后低浓度的咪唑溶液（比如500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 8.0) and 20 mM imidazole）预洗，除去非特异性结合蛋白，然后高浓度咪唑溶液（500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 8.0) and 500 mM imidazole）洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；再透析或者过膜除盐，浓缩，得到目的蛋白A。 |
4楼2013-06-19 07:56:57
roomofxw
木虫 (正式写手)
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5楼2013-06-19 09:11:07
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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1 已知膜蛋白A和信号蛋白Src存在直接相互作用，物质B和蛋白A结合后， 可诱发Src磷酸化活化，设计至少6个以上分子生物学实验，证实上述发现。 这题，我来回答。 实质上这题分为三个小问题：1.蛋白质-蛋白质相互作用，2.蛋白质-小分子相互作用，3.蛋白质的磷酸化检测。 1.蛋白质-蛋白质相互作用，2.蛋白质-小分子相互作用，都可用NMR，CD，UV，能量转移等。 蛋白质-蛋白质相互作用还可以用绿色荧光蛋白，电子显微镜直接观测，X-ray diffraction，质谱，原子力显微镜观测，WB等，膜蛋白A和信号蛋白Src的检测用蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法研究。 物质B是蛋白质，研究物质B和蛋白A结合研究用的方法同上。物质B是是非蛋白质，研究物质B和蛋白A结合研究用的方法按照蛋白质-小分子相互作用的研究技术，用NMR，CD，UV，能量转移等，还可以用有机荧光试剂标记上物质B，结合蛋白A后，观测蛋白A后的原有的自发荧光的变化，后者在蛋白A分子表面标记上荧光猝灭集团，当物质B，结合蛋白A前后，用荧光显微镜观测荧光是否发生猝灭。 3.蛋白质的磷酸化检测。方法很多了，WB----现在有卖的磷酸化的蛋白质的当克隆抗体。双向电泳-----在磷酸化前后各做一次。质谱直接测定蛋白质的磷酸化的分子量变化。NMR测出磷酸化后的蛋白质的全构象。磷酸化的蛋白质的肽谱分析----先有限水解再用二维电泳。X-ray diffraction. 每一种个问题实验都是不少于6种方法，1或2 的试验方法与3 是独立的，也就1或2 的试验方法与3的试验方法是能够以不同方式组合起来，那就远不止六种了。 |
7楼2013-06-20 12:35:32
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