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蛋白质结合金属离子的结合位点的确证方法
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1.肌钙蛋白C和钙离子结合位点如何确证？或者类似的金属离子和蛋白质结合位点的确认的方法。 2.检测出的C-和N-端的肽段序列的变化与结合位点的关系。 跪求。。 |
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【答案】应助回帖
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254131473(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:56:56
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我把你的问题分为三个问题加以讨论。 1.肌钙蛋白C和钙离子结合位点如何确证？或者类似的金属离子和蛋白质结合位点的确认的方法。 答：事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）。 肌钙蛋白C一级结构的的氨基酸全序列中可能与金属离子形成螯合键的氨基酸的位点----在一级结构中的位置，判定出结合有金属离子形成螯合键的氨基酸的具体位点。1.根据目的蛋白质的全序列中可能与金属离子形成螯合键的氨基酸的位点----在一级结构中的位置，判定出结合有金属离子形成螯合键的氨基酸的具体位点。 2.金属离子和蛋白质结合位点的确认的方法。 答：确定金属离子和蛋白质结合位点的确认的方法。方法很多了，举例如下： （1）基于NMR的方法。最简单的方法：可以用NMR解析结合金属离子的蛋白质的完全的三维结构，要用自选量子数不为零的同位素加以标记。 （2）基于质谱的方法。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；用强的螯合试剂夺取结合金属离子的蛋白质中的金属离子，得到脱金属的蛋白质分子，然后用超滤除去螯合试剂和金属离子，剩下脱金属的蛋白质分子；分别用胰蛋白酶有限水解结合金属离子的蛋白质和不结合结合金属离子的蛋白质，分别过质谱，辨别出m/z不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；用分子筛层析分离出含有金属的蛋白质分子和脱金属的蛋白质分子质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）；取出以上质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量），进行测序---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后用串联质谱直接对于含有金属离子的肽片段测序即可判定出结合有金属离子形成螯合键的氨基酸的具体位点（对比不含金属的该段的质谱即可知道）。 （3）基于X-ray diffraction的方法。用NMR解析结合金属离子的蛋白质的完全的三维结构，前提是能够获得结合金属离子的蛋白质的单晶体。 （4）基于肽谱分析的方法。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；用强的螯合试剂夺取结合金属离子的蛋白质中的金属离子，得到脱金属的蛋白质分子，然后用超滤除去螯合试剂和金属离子，剩下脱金属的蛋白质分子；分别用胰蛋白酶有限水解结合金属离子的蛋白质和不结合结合金属离子的蛋白质，分别过电泳，辨别出两次电泳图上位点不一样一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；挖出位置不一样的两侧的电泳图上的肽斑回收其中肽段；对电泳图上位点不一样的多肽片段进行测序（Edman降解法即可，Edman降解法本身无法测定修饰的氨基酸，这本身也是一种信息）---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后根据目的蛋白质的全序列中可能与金属离子形成螯合键的氨基酸的位点----在一级结构中的位置，判定出结合有金属离子形成螯合键的氨基酸的具体位点。 3.检测出的C-和N-端的肽段序列的变化与结合位点的关系。 答：用C-和N-端的肽段序列的变化后的目的蛋白质，用有限水解或者构建载体生物合成等获得。 然后重复"2"的研究方法。 参考文献： MMB-173-calcium-binding protein protocols –Vol-2 & Vol-1(free) http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5940632 个人意见仅供参考！ |
2楼2013-06-17 10:51:13
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3楼2013-06-17 10:52:34
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【答案】应助回帖
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补充五点： 1.如果直接从完整的蛋白质中去除螯合的金属离子，比较困难，可以先进行有限酶解，然后根据事先知道的氨基酸全序列和酶解位点，挑选出可能的螯合的金属离子的肽片段，用分子筛层析分离，然后侵泡于强的螯合试剂中，去除螯合的金属离子会比较容易。 2.去除蛋白质分子中的螯合的金属离子的方法也可以通过将对螯合的金属离子的提供配位键的氨基酸的侧链加以氧化的方法，而释放出被螯合的金属离子 3.我在二楼讲的试验方法是通用方法，既不知道金属离子与蛋白质上的哪些氨基酸残基会有相互作用，也不知道相互作用形成的键是什么类型的键，甚至不知道结合了多少金属离子的情况下使用的通用实验方法。 4.我在二楼讲的试验方法“（4）基于肽谱分析的方法”中的电泳是“双向电泳”。 5.该实验方法同样能够搬到任何的蛋白质被无机或有机小分子共价修饰的具体位点的确定的实验方法上。 |
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2541314734楼2013-06-17 22:17:20
5楼2013-06-18 09:33:39
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254131473: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 很热心，收获很大 2013-06-18 14:24:30
254131473: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 很热心，收获很大 2013-06-18 14:24:30
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第一问回答：只有知道蛋白质全序列情况下才可能用软件预测出其三维结构，而且不可能100%，能够达到50%准确率就很不错了，只知道其中一部分序列根本无法进行蛋白质空间结构预测或者模拟。 第二问回答：不行！因为金属离子与蛋白质结合不仅与结合的氨基酸有关，而且与整个蛋白质的构象有关，这也是蛋白质的生物功能的具体表现之一。所以不能把目的切成小的肽段，分别于金属离子放到同意溶液中，检测结合情况。而且不同的金属离子浓度下的蛋白质的构象本身也并不相同。这会进一步引起目的蛋白质结合金属离子的能力。 |
6楼2013-06-18 09:47:59
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8楼2013-06-20 11:40:09
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