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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）
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huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么大家都说overlap比较麻烦呢，我觉得挺简单的呀，我这边做的PCR很大一部分都需要overlap的，楼主需要突变的点离的近吗，如果距离只有20bp以内的话4条引物就行了，距离比较远的话就需要6条引物，设计的时候需要搭链的部分在15bp以上，tm值在56~60度一般就没有问题了，买定点突变试剂盒还是太贵了
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11楼2013-06-17 15:51:14
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
我也看不明白为什么说overlap麻烦。花得时间完全一样，实际只不过多一轮PCR，大概就是2小时事情。
关键是overlap可以得到大量产物，可以检查条带，troubleshooting容易得多。
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12楼2013-06-17 23:43:16
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547star

木虫 (著名写手)
楼主给的方法不是overlap，是引物搭上质粒单链模板再延伸、连接成环，再通过酶切减少背景和筛选鉴定。如果保证买到的试剂质量好，也是好方法。overlap和stratagene反向PCR法都是做突变比较常用的好方法。
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为什么
13楼2013-06-18 07:27:42
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