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11楼2013-06-05 17:19:41

stt19890101

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7楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-05 15:28:55
你这个黑乎乎的一片一般原因有2：一是封闭效果不好二是压片时间过长另外就是你这个抗体质量肯定不行，目的蛋白含量也不高

封闭效果不好？请问是封闭时间不够呢还是封闭的东西不行？我用的3%脱脂奶粉TBST缓冲液，压片时间缩短也看不到目标，应该不是压片时间的问题，我用的抗体是santa的，上样在80微克，

12楼2013-06-05 17:22:28

stt19890101

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2楼: Originally posted by 1759005335 at 2013-06-04 20:56:30
洗膜的时候是不是几张片子压在一起了

没有啊都是一个一个盒子的

13楼2013-06-05 17:24:04

songzuowei

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12楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:22:28
封闭效果不好？请问是封闭时间不够呢还是封闭的东西不行？我用的3%脱脂奶粉TBST缓冲液，压片时间缩短也看不到目标，应该不是压片时间的问题，我用的抗体是santa的，上样在80微克，...

脱脂奶粉的话我一般用5%的，BSA用3%的，不知道你封闭多长时间，一般4°过夜效果很好

14楼2013-06-05 17:24:22

cicelyzh

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:47:12

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10楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:18:48
如果能做出GAPDH是不是就能说明不是样品的问题？求解。我的蛋白上样至少在80微克，...

一般的看家基因的表达量会比较大，而且抗体也是很好用的。目的蛋白的表达量和抗体都不好说，所以出现这种情况也不奇怪。如果上样量已经很大了，试试调整一抗的稀释倍数。

15楼2013-06-06 02:48:38

xiangyu9356

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stt19890101: 金币+2, ★有帮助 2013-06-08 13:17:37

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10楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:18:48
如果能做出GAPDH是不是就能说明不是样品的问题？求解。我的蛋白上样至少在80微克，...

你的内参没问题，基本上可以说明不是样品准备的问题了，上样80肯定算多的了。你说的LDLR和SREBP2两个蛋白本身就不是很好做，建议你更换新的一抗试试。另：查看一抗和二抗种属以及你所研究的细胞或组织是否高表达二者。祝好！

满堂花醉三千客，更无一人是知音。

16楼2013-06-06 13:27:13

stt19890101

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16楼: Originally posted by xiangyu9356 at 2013-06-06 13:27:13
你的内参没问题，基本上可以说明不是样品准备的问题了，上样80肯定算多的了。你说的LDLR和SREBP2两个蛋白本身就不是很好做，建议你更换新的一抗试试。另：查看一抗和二抗种属以及你所研究的细胞或组织是否高表达二 ...

好的谢谢

17楼2013-06-08 13:17:54

stt19890101

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14楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-05 17:24:22
脱脂奶粉的话我一般用5%的，BSA用3%的，不知道你封闭多长时间，一般4°过夜效果很好...

封闭一抗就是过夜的一般都在12个小时我没有用过BSA bsa是买的现成的吗？效果怎么样

18楼2013-06-08 13:19:24

songzuowei

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18楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-08 13:19:24
封闭一抗就是过夜的一般都在12个小时我没有用过BSA bsa是买的现成的吗？效果怎么样...

BSA是胎牛血清啊成瓶粉末状的现用现配比较贵理论上肯定BSA效果好不过用脱脂奶粉就可以了

19楼2013-06-08 13:25:46

leechau2007

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:47:28

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8楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:15:36
我的蛋白是是低密度脂蛋白受体和胆固醇调节结合元件2，我用的就是Santa的一抗，六个抗体都是这样，我用的都是脱脂奶粉封闭的，之前老师再香港时候都是这样做的虽然特异性不好也能做出来条带，我压膜时间缩短也看不 ...

牛血清白蛋白和奶粉一样都是质量分数5%的TTBS溶液，封闭的时间加长点，可以封闭两个小时，条带一片黑和转膜时间没有多大关系，正常转就可以，一抗的浓度可以继续稀释，同时加大二抗浓度。如果还是这样，就要考虑和抗体公司扯皮了。

20楼2013-06-13 19:42:27