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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot 封完抗体，目标蛋白看不到，但是看家很好是怎么回事啊
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-06-05 09:30:49
感觉可能是一抗的问题。

我们买了那么多一抗都是这样的问题  是不是santa的抗体很不靠谱啊
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11楼2013-06-05 17:19:41
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-05 15:28:55
你这个黑乎乎的一片一般原因有2：一是封闭效果不好二是压片时间过长 另外就是你这个抗体质量肯定不行，目的蛋白含量也不高

封闭效果不好？请问是封闭时间不够呢还是封闭的东西不行？我用的3%脱脂奶粉TBST缓冲液，压片时间缩短也看不到目标，应该不是压片时间的问题，我用的抗体是santa的，上样在80微克，
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12楼2013-06-05 17:22:28
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1759005335 at 2013-06-04 20:56:30
洗膜的时候是不是几张片子压在一起了

没有啊 都是一个一个盒子的
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13楼2013-06-05 17:24:04
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:22:28
封闭效果不好？请问是封闭时间不够呢还是封闭的东西不行？我用的3%脱脂奶粉TBST缓冲液，压片时间缩短也看不到目标，应该不是压片时间的问题，我用的抗体是santa的，上样在80微克，...

脱脂奶粉的话我一般用5%的，BSA用3%的，不知道你封闭多长时间，一般4°过夜效果很好
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14楼2013-06-05 17:24:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:47:12
引用回帖:
10楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:18:48
如果能做出GAPDH是不是就能说明不是样品的问题？求解。我的蛋白上样至少在80微克，...

一般的看家基因的表达量会比较大，而且抗体也是很好用的。目的蛋白的表达量和抗体都不好说，所以出现这种情况也不奇怪。如果上样量已经很大了，试试调整一抗的稀释倍数。
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15楼2013-06-06 02:48:38
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xiangyu9356

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-06 15:16:02
stt19890101: 金币+2, ★有帮助 2013-06-08 13:17:37
引用回帖:
10楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:18:48
如果能做出GAPDH是不是就能说明不是样品的问题？求解。我的蛋白上样至少在80微克，...

你的内参没问题，基本上可以说明不是样品准备的问题了，上样80肯定算多的了。你说的LDLR和SREBP2两个蛋白本身就不是很好做，建议你更换新的一抗试试。另：查看一抗和二抗种属以及你所研究的细胞或组织是否高表达二者。祝好！
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满堂花醉三千客，更无一人是知音。
16楼2013-06-06 13:27:13
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by xiangyu9356 at 2013-06-06 13:27:13
你的内参没问题，基本上可以说明不是样品准备的问题了，上样80肯定算多的了。你说的LDLR和SREBP2两个蛋白本身就不是很好做，建议你更换新的一抗试试。另：查看一抗和二抗种属以及你所研究的细胞或组织是否高表达二 ...

好的  谢谢
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17楼2013-06-08 13:17:54
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-05 17:24:22
脱脂奶粉的话我一般用5%的，BSA用3%的，不知道你封闭多长时间，一般4°过夜效果很好...

封闭一抗就是过夜的  一般都在12个小时   我没有用过BSA  bsa是买的现成的吗？效果怎么样
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18楼2013-06-08 13:19:24
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-08 13:19:24
封闭一抗就是过夜的  一般都在12个小时   我没有用过BSA  bsa是买的现成的吗？效果怎么样...

BSA是胎牛血清啊 成瓶粉末状的 现用现配 比较贵 理论上肯定BSA效果好 不过用脱脂奶粉就可以了
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19楼2013-06-08 13:25:46
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leechau2007

木虫 (初入文坛)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:47:28
引用回帖:
8楼: Originally posted by stt19890101 at 2013-06-05 17:15:36
我的蛋白是是低密度脂蛋白受体和胆固醇调节结合元件2，我用的就是Santa的一抗，六个抗体都是这样，我用的都是脱脂奶粉封闭的，之前老师再香港时候都是这样做的虽然特异性不好也能做出来条带，我压膜时间缩短也看不 ...

牛血清白蛋白和奶粉一样都是质量分数5%的TTBS溶液，封闭的时间加长点，可以封闭两个小时，条带一片黑和转膜时间没有多大关系，正常转就可以，一抗的浓度可以继续稀释，同时加大二抗浓度。如果还是这样，就要考虑和抗体公司扯皮了。
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20楼2013-06-13 19:42:27
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