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vita198861

铁虫 (正式写手)

[求助] 求教定量PCR

图1之前做的GADPH的定量的溶解曲线,普通PCR是没问题的。
求教定量PCR
图1.jpg
后来因为污染,重新订了引物,当然也重新提了RNA反转录cDNA。
跑出来来的普通PCR是图2。
求教定量PCR-1
图3.jpg
最右边那个是GADPH,这一批12个引物跑出来都有一个600+的杂带。我觉得可能是RNA的问题,我就重新提了一次,跑出来是图3

求教定量PCR-2
图2.jpg

杂带淡了很多,但还是有。GAPDH是12,marker是600的。
只跑了GAPDH标线看。溶解曲线结果图4


求教定量PCR-3
[图4.jpg前面弯弯曲曲到底为什么呢?RNA已经重提,引物是新的之前也试过没问题。
好痛苦,谁能指导一下···

[ Last edited by vita198861 on 2013-5-30 at 12:13 ]
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louisa俊

银虫 (小有名气)

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vita198861(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-30 18:52:07
溶解曲线前面有杂峰,说明有其他非特异性扩增。。。可能是引物的问题,也可能是你提的RNA里面含有杂质
2楼2013-05-30 13:16:18
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没有除DNA的步骤吗?为什么会有600bp条带?
另外,普通PCR的结果不能用来知道Q-PCR,Q-PCR的结果通过做NTC和样品的溶解曲线和扩增曲线来判断。如果怀疑Q-PCR有杂带,可以拿Q-PCR产物跑电泳看看,甚至测序,有些杂志就有这样的要求
每个年龄都有其最应该做的事,但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-06-01 15:15:32
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

其实我觉得 不会完全 一点杂带都没有吧

有时候你 跑电泳 它就是会 出来一些 杂带的
4楼2013-06-03 00:13:48
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