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yq19880610

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增

PCR扩增时，内参的退火温度是要和目的引物的退火温度一致的吗？
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1楼 2013-05-28 08:37:33
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protura

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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yq19880610(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-28 13:43:29
没有那么觉得，但要同时扩增的话，建议最好别相差太大，3-5度应该都可以接受，有时同一参数的上下游引物的退火温度都相差好几度，但PCR一样能扩出来。
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2楼2013-05-28 10:06:39
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yq19880610

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by protura at 2013-05-28 10:06:39
没有那么觉得，但要同时扩增的话，建议最好别相差太大，3-5度应该都可以接受，有时同一参数的上下游引物的退火温度都相差好几度，但PCR一样能扩出来。

那如果内参退火温度和几个目的引物退火温度都不一样，是都是分开P，然后用同一个内参来比较的吗？
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3楼2013-05-28 10:13:27
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peng~yu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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yq19880610(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-28 13:43:43
对于你的问题来说~我虽然不能保证每一个目的片段的引物和内参引物的退火温度都是一样的~但是对于大部分的PCR来说~用58度退火是可以扩出来的~我们一般都是做58度的退火温度，当然具体的还是应该看引物的Tm值~
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4楼2013-05-28 10:17:39
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hyhyyl

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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yq19880610(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-28 13:43:53
gyesang: 回帖置顶 2013-05-28 13:43:57
你做PCR加入内参的目的是定量吗，还是。。。？
不管何种目的，理论上尽可能一致吧，不然容易出现一个有带，另外没带的现象。
如果实验室有梯度PCR，则内参和样品组各选择相应最适应的退货温度即可。
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希望成为大家的好朋友
5楼2013-05-28 11:08:11
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liuli189726

新虫 (初入文坛)
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yq19880610(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-28 13:44:12
不一定是的，退火温度是根据你扩增的基因来定的，一般不同的基因退火温度可能是不一样的，但也不排除不同的基因有相同的退火温度。所以你的内参基因和目的基因要分别摸索最佳的退火温度，可能一致，但也可能不一致。
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6楼2013-05-28 11:18:16
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protura

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yq19880610 at 2013-05-28 10:13:27
那如果内参退火温度和几个目的引物退火温度都不一样，是都是分开P，然后用同一个内参来比较的吗？...

最好能弄成一个通用的退火温度，相差别太大就行，这样几个参数都能一次P出来，退火温度可以根据几个参数引物的退火温度，就低原则。
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7楼2013-05-29 08:47:11
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