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759986494金虫 (著名写手)
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求DGGE步骤
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20093651
铁杆木虫 (职业作家)
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2楼2013-05-26 23:02:18
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（1）制胶：首先需要将玻璃板洗净，然后小心地将长短两块玻璃板装配到灌胶架上。分别量取15 mL 40%和65%变性剂溶液，加到两支试管中，每管加15 µL TEMED和120 µL 10%过硫酸铵，迅速摇匀之后，用两只注射针筒分别吸取高、低浓度的变性剂溶液，采用三通管分别连接这两支针筒和一只注射针头，将针头小心地插进玻璃板之间的缝隙中，针头与水平面保持垂直。使用梯度胶制备装置制备浓度梯度为40~65%的垂直胶，快速完成灌胶之后插上梳子。需要注意的是，灌胶需要尽可能保持匀速，且液体应从针头垂直流下。如不垂直，则有可能是玻璃板没有洗净所致。 （2）电泳：在等待聚丙烯酰胺胶凝固的同时加热电泳槽中的TAE缓冲液。待聚丙烯酰胺胶凝固之后拔出梳子，将20 µL PCR扩增产物与Loading Buffer混合后加入到梳孔中并开始电泳。打开加热器和水泵，电压可设置150 V，运行时长7 h。电泳时电泳槽中TAE缓冲液的温度保持在60 oC。电泳完成后，关掉电源和系统（加热器、泵和开关）。取出温度控制仪并将它安放在Dcode防护帽架上，再将装有玻璃板的装置取出，小心地将玻璃板从装置上分离，再将短玻璃板从凝胶上移走，此时凝胶平铺在长玻璃板上。 （3）染色：用DNA荧光染料涂抹聚丙烯酰胺凝胶表面，或将凝胶浸泡在DNA染料中，避光条件下对DNA进行荧光染色20 min，之后采用脱色摇床洗去凝胶表面的荧光染料。 （4）检测和分析：将凝胶转移至成像系统中，首先打开白灯确定凝胶位置，再打开紫外观察条带。采用凝胶分析软件（如Quantity One）对DGGE图谱中条带的强度进行分析。 |
3楼2013-06-19 15:17:33