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DGGE 垂直电泳 灌胶技术 各位大侠帮帮忙
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想确定变性剂的梯度范围，请问DGGE垂直电泳的胶是怎么灌的呢，梯度变化是水平的，那怎么灌呢。看了一个文献貌似说也是用伯乐的小车，一管高，一管低，那梯度是怎么形成的呢。那和我们平时跑得正常的DGGE 也就是水平的DGGE 灌胶不就是用小车灌的吗？ 第二个是我每次灌胶拔完梳子之后两边的空挺平的，可是中间的胶孔就会晚上拱形成一个弧度，那在这样的孔里加样跑出来的条带都不直，还有做胶是空附近还总是有气泡。 大家看看我这图，我总感觉条带没分开，是电泳时间影响还是变性剂的梯度范围 我的条件是180v,6h，变性剂30-60%,上样量25ul。 MARKER也会变性，怎么标注呢。 新手问问大家有没有什么小技巧或注意事项。请大家赐教谢谢  1.JPG |
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13楼2013-11-19 17:18:26
志子
至尊木虫 (文坛精英)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
mandywang: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-05-26 16:01:26
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mandywang: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-05-26 16:01:26
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制备平行胶： 平行胶中从上至下变性剂的浓度递增。这种胶适用于分析大量样品。 1) 与制备标准聚丙烯胺凝胶一样制备胶板。 2) 从丙烯酰胺和两种变性剂贮存液中取两份等体积溶液以符合要求的变性剂浓度范围。溶液的总体积一般为刚好覆盖胶板。丙烯酰胺的浓度取决于DNA 片段的大小，对于DNA 片段大小为≥300bp 的丙烯酰胺的浓度为6%， 而长度＜300bp 的DNA 片段，丙烯酰胺的浓度为12%。 3) 加高浓度变性剂溶液到梯度生成器右槽中(该溶液将首先通过梯度合成器进入胶板间的空隙)，打开连接梯度生成器两端的开关，让一些溶液流入左槽内关上开关，用吸管把它们移回到右槽(目的是确保两槽之间无气泡的阻隔)。然后把低浓度变性剂溶液加到梯度生成器左槽中。 4) 搅拌这两个槽中溶液的同时向其中加入4.5μL/mLl0%的过硫酸铵和1μL/mL 的TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 5) 轻轻打开两槽之间的开关及梯度生成器出口的开关，灌胶时两槽内的溶液应处于搅拌状态(尤其高浓度溶液槽应搅拌)，溶液受重力影响通过一个放在两块玻璃板之间的顶部的细塑料管流过梯度生成器。流速应保持一定大小以保证溶液在凝聚之前所有溶液都应注入到两层玻璃板之间。(凝聚速度可通过调整过硫酸铵和TEMED 的浓度来调节)。 6) 胶板充满后，在其顶部插入梳子并将其放平，凝聚至少30min。(胶可事先灌好并于4℃贮存几天)。 制备垂直胶 垂直胶含有丙烯酰胺的浓度是固定的，垂直于电泳方向有一个线性递增的变性剂梯度。这种胶适用于确定分离含有核苷酸改变的DNA 片段的最佳梯度范围。垂直胶的制备大体相似和平行胶的制备，但也有所不同： 1) 像标准的聚丙烯酰胺凝胶一样制备胶板，但其顶部不插入梳子。 2) 准备一块比梳子稍短的涂上润滑剂的间隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，这样左边就留下一个缺口。用夹子夹紧这一边。把胶板旋转90°这样和缺口相连的这一面就转到最上面了。胶液将通过该缺口进入两玻璃板之间。如前所述的方法灌胶。 3) 胶完全凝固之后，将胶板垂直立起，轻轻移出胶顶部的间隔片。胶的顶部就会出现大而平的孔，这样就可以进行电泳了。 注意： 在混合和灌胶时应避免产生气泡。 有时聚丙烯酰胺凝胶的左侧会出现缩水现象以致在胶的顶部到底部之间会产生空气通道，可用2%熔化的琼脂糖凝胶将其充满。 所有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效。 电泳时凝胶温度必须保持恒定，要达到这一要求，可把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行(但温度稍高或低一点都可采用)。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可。 |
2楼2013-05-26 01:59:33
3楼2013-05-26 16:01:03
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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mandywang: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-26 16:07:22
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mandywang: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-26 16:07:22
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首先确定好 变性剂梯度范围正确的话 建议吧 胶浓度 提高一个梯度。比如 通常8%的胶 用来跑300 左右的片段 提高到10% 或者更高一点， 这样再去摸索电泳时间和电压组合 通常出来的条带会分的比较开 而且形状也漂亮。 这张图 做的还不错。不过条带有点糊 。 要用去离子键酰胺 和 去离子水，而且过硫酸铵溶液最好现配 。 瓶子 器皿啥玩意要刷洗干净。 细节 决定成败 。 |
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mandywang4楼2013-05-26 16:01:21