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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 作物 » 叶片抗氧化酶活性测定方法
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lly2010320

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2013-05-21 10:27:05
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yangyang1991

铁杆木虫 (著名写手)

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lly2010320(sweety代发): 金币+2, 鼓励应助 2013-08-19 09:57:27
小木虫上有！帮你摘过来
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
一、        超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。        
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。
二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。
1、        过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以60个样为准）：
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（3）样品测定：
取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）每30S读数一次。
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）   (u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。
2、        过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）    (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

四、超氧阴离子自由基（O2-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；
（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。
2、O2.-含量的测定
（1）样品液提取方法同SOD测定；
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。
（3）在25℃下保温1小时；
（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速摇匀；
（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；
（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；
（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+      NO2-＋H2O2 ＋H2O 计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示）。
O2.-产生速率=（C×V）/（t×W）   （nmol min-1g-1鲜重）
C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)
参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990，（6）：55～57

五、丙二醛含量的测定
1、试剂配制：
10%TCA：100g 三氯乙酸  →  1L
0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸  →  500ml 10%TCA （避光）
2、测定步骤:
0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷却，离心→上清OD450，OD532，OD600
3、计算组织中MDA含量：
MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
MDA含量(umol/g FW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。

六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）
（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；
（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；
（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还可以计算植株伤害程度：
           伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%

七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。
（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液）。
标准曲线的制作：
配制0～100μg/ml血清白蛋白血液
管号           1        2          3          4          5         6
100μg/ml牛血清白蛋白(ml)           0      0.2        0.4        0.6        0.8        1.0
蒸馏水量(ml) 1.0      0.8        0.6        0.4        0.2        0
蛋白质含量（ml）        0      0.02       0.04      0.06      0.08        0.10
配制0～1000μg/ml血清白蛋白血液
管号         7         8        9         10          11        12
100μg/ml牛血清白蛋白(ml)        0        0.2        0.4        0.6        0.8        1.0
蒸馏水量(ml)        1.0      0.8        0.6        0.4        0.2        0
蛋白质含量（ml）      0        0.2        0.4        0.6        0.8        1.0

0.1ml 酶液（做三个重复） + 2.9ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。
2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。
（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。
八、彗星实验
采用机械分离方法分离植物细胞核：植物组织放人预冷的培养皿中，冰上冷冻10min，加人一定体积缓冲液，机械分离叶片细胞核，以缓冲液充分冲洗叶片使细胞核游离，并倾斜培养皿使细胞核聚集，吸取30斗L细胞核的悬浮液加入一定的溴化乙锭染色后于荧光显微镜下观察或进行彗星实验．机械分离方法分别采用Sorensen buffer、1×PBS、0．4tool•L～Tris—HCl 3种缓冲液进行
机械法分离细胞核取处理过的根尖或幼苗叶片切成适当大小.以烟草叶片为例，切成1cm×2cm 放于事先在冰上预冷的直径60cm 培养皿中，以250μL（400mM、pH7.0）Tris-HCl 或1×PBS 展开，用新的不锈钢刀片在叶片或根尖上轻划，并用缓冲液反复冲洗即可将游离出来的细胞核从叶片或根尖上冲洗到缓冲液中，操作中注意将培养皿倾斜放置以达到富集细胞核的目的，此外，操作要在微暗或黄光下进行，避免分离过程中造成人为的细胞核损伤。
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5楼2013-05-23 17:00:50
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杨小铮

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
SOD,POD,MDA,和CAT都可以用0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液研磨测定
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2楼2013-05-23 10:02:26
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liuhongyun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意二楼的，还可以测可溶性糖，可溶性蛋白。酶液提取后冰箱冷藏保存，一周内测完！
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3楼2013-05-23 14:10:03
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普通回帖

lly2010320

禁虫 (初入文坛)
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4楼2013-05-23 15:56:56
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xueyan205

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuhongyun at 2013-05-23 14:10:03
同意二楼的，还可以测可溶性糖，可溶性蛋白。酶液提取后冰箱冷藏保存，一周内测完！

你好，问下同时研磨后，酶液放到冰箱里一周内酶活性不会变化吗？要超低温冰箱还是普通的冰箱就可以？
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6楼2013-06-30 16:38:33
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liuhongyun

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xueyan205 at 2013-06-30 16:38:33
你好，问下同时研磨后，酶液放到冰箱里一周内酶活性不会变化吗？要超低温冰箱还是普通的冰箱就可以？...

不会有变化的，不信你可以试试！普通冰箱冷藏就可以了！
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7楼2013-07-01 07:50:14
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xiaonong

银虫 (小有名气)
8楼2013-07-07 17:23:40
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lonerice

专家顾问 (著名写手)

水稻生理学专家
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuhongyun at 2013-05-23 14:10:03
同意二楼的，还可以测可溶性糖，可溶性蛋白。酶液提取后冰箱冷藏保存，一周内测完！

这个方法 挺好的。能不能发给我一份呢，谢谢。
shuqin180@sohu.com 谢谢
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评论、责怪、担忧-最浪费生命
9楼2013-07-07 19:15:44
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xiaonong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

大家最近也在做生理实验啊，，不知道你们看到李合生版的关于测可溶性糖含量的实验中的标准曲线有没有疑问，我个人觉得是错的，而且王学奎和邹琦的都跟李合生一样，具体请看
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6095744
发表你们的高见
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看不到未来，所以恐惧
10楼2013-07-07 19:54:10
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