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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 目的片段和T载体连接后PCR条带诡异
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chenyawei

金虫 (小有名气)
★
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:47:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-05-20 17:30:23
现在正在做呢，但是为什么PCR做不出来呢...

有可能是引物特异性不好，P出其他的东西了。maker对照的清楚吗？你的1500的有可能是目的片段吧。我们一般做菌落PCR，一条目的基因引物，一条载体引物的做
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11楼2013-05-20 19:05:26
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by chenyawei at 2013-05-20 19:05:26
有可能是引物特异性不好，P出其他的东西了。maker对照的清楚吗？你的1500的有可能是目的片段吧。我们一般做菌落PCR，一条目的基因引物，一条载体引物的做...

我的片段有1200，P出来明显大了。还有我没有载体引物，所以没有做
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12楼2013-05-20 21:53:31
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-22 13:41:22
推测原因:
1) 不是单菌落扩增结果?!
2) 引物扩增不特异!你的引物在片段上和载体上都有,不是载体上引物吧?

建议:
1)   载体说明上应该有检测引物序列RV-M/M13-47,用这对引物扩增检测试一试吧!
2)   或提出质粒后直接酶切鉴定,就可以,判定是否含目的基因.
3)   如果就想PCR鉴定,请设定对照或心中有数:
    考虑一下你的质粒全长多少?   质粒全长: pMD19-T 约2700bp+片段1200bp?=3900bp?
       空载应该扩出多大片段?(扩增时可以用空载质粒做个阴性对照)
       目的质粒应该扩出多大片段?
       设定对照再分析就容易找出原因!
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13楼2013-05-22 13:15:47
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stevenshi021

新虫 (小有名气)
都是什么实验标准，做实验没有对照那么这个实验与没有做是一样的。从小就要培养严谨的实验态度。
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14楼2013-05-23 10:20:23
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-23 10:20:23
都是什么实验标准，做实验没有对照那么这个实验与没有做是一样的。从小就要培养严谨的实验态度。

嗯嗯，谢谢
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15楼2013-05-23 12:20:37
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易翔仪冲

新虫 (初入文坛)
我也遇到了这种情况
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16楼2013-06-14 10:12:24
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 易翔仪冲 at 2013-06-14 10:12:24
我也遇到了这种情况

我的是载体不行了，全部都是自连，后连换了新的载体就好了。
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17楼2013-06-14 13:58:20
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