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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒转化
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒转化

最近几天一直在做转化，第一天下午涂板，第二天晚上10点多才能长出来，用牙签挑取单菌落，菌P，然后把牙签在盛有LB+AMP的液体培养基的1.5mlEP管中涮一下，37°培养，菌P显示有目的条带，然后把对应的EP管中的菌液加入到培养瓶中（LB+AMP）培养，菌体长得很慢，并且，再次提取质粒酶切，没有目的条带，不知道什么原因，请各位大神指教啊
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1楼 2013-05-15 16:43:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

20083630zhan

木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by zsewqa129 at 2013-05-15 21:07:39
我前几天也是这种情况，结果是培养基污染了没有载体的大肠杆菌，长菌会慢些，呵呵
可能还有其他的原因，你在找找

但是培养基时LB+AMP的抗性平板啊？那你是怎么处理的啊？
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8楼2013-05-15 21:25:42
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-05-16 08:28:08
嗯，受教了，谢谢了，那一般用的浓度是多少啊？大约长多长时间啊...

Amp 在50%乙醇中配置母液，过滤除菌，-20度保存，使用时按1:1000加入灭菌后降温培养基中。倒好的平板4度保存，使用时不超过14小时。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
15楼2013-05-16 16:06:50
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
水里100mg／ml也没问题，乙醇好处是不会结冰，坏处是挥发

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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20083630zhan
18楼2013-05-16 20:42:57
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
20083630zhan: 金币+1, ★有帮助 2013-05-19 08:59:13
37度培养不应该那么长时间才长出来的啊。第一次菌P有可能是板上的残留啊。怀疑没有连进去 或长的杂菌
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25楼2013-05-18 15:43:19
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普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 18:04:29
多半是污染, 楼主用PCR检查一下摇出来的菌液.
至于为什么头一天可以做出PCR, 我猜原因是你用的引物P出了残留在LB板上的模板.
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20083630zhan
2楼2013-05-15 16:51:06
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 18:04:35
你这多半是连接产物没有连接成功，是些空载体
把你的载体和PCR产物酶切回收后的样品跑个凝胶看看，质量好的话在重新连接转化
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生物化学与分子生物学
3楼2013-05-15 17:34:44
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lidonghong at 2013-05-15 17:34:44
你这多半是连接产物没有连接成功，是些空载体
把你的载体和PCR产物酶切回收后的样品跑个凝胶看看，质量好的话在重新连接转化

但是我菌P的时候为什么会有我的目的条带啊？
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4楼2013-05-15 20:53:33
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lidonghong at 2013-05-15 17:34:44
你这多半是连接产物没有连接成功，是些空载体
把你的载体和PCR产物酶切回收后的样品跑个凝胶看看，质量好的话在重新连接转化

我酶切回收后，跑过胶 ，有目的条带，然后我才做的连接啊
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5楼2013-05-15 20:55:06
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-15 16:51:06
多半是污染, 楼主用PCR检查一下摇出来的菌液.
至于为什么头一天可以做出PCR, 我猜原因是你用的引物P出了残留在LB板上的模板.

有这个可能
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6楼2013-05-15 20:56:13
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
★
20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-15 21:23:18
本帖内容被屏蔽

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20083630zhan
7楼2013-05-15 21:07:39
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:59:42
AMP抗性在14小时内长出来的差不多，之后的大多是假的。
如果你的基因对细菌有生长压力导致长得慢，做克隆不要用amp。。
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9楼2013-05-15 21:55:26
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-05-15 21:55:26
AMP抗性在14小时内长出来的差不多，之后的大多是假的。
如果你的基因对细菌有生长压力导致长得慢，做克隆不要用amp。。

我的基本上都是20h以后长出来的啊
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10楼2013-05-15 22:10:27
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