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iamvivien

新虫 (初入文坛)

[求助] western结果跟考马斯兰，质谱结果不符合！

化学背景的生物新人跪求大家指点！！！是这样的，合成的drug固定到dynabeads上面后，跟空白组blank beads对照跑胶，然后找出特异蛋白带，跑了质谱，发现一个已知应该结合的蛋白，特异性结合到我的probe上面，这个实验重复做了多遍，一直特异性很好，没有在空白beads上面发现。然后订了此蛋白的一抗，然后又重复实验，western结果让我真的哭了出来。。。空白组跟实验组都有一个很明显的band！

考马斯兰染色的时候也是发现空白组有非特异结合，但是明显实验组band更intensive!

然后查了很多资料，说western的一抗敏感度强，可以检测pg的蛋白，但是质谱要至少ng的蛋白量才能检测到，是不是有这种可能，我的蛋白结合空白组但是不如我的实验组强，并且空白组的结合蛋白量不能够被质谱检测出来（小于ng），而western实验太敏感，这样空白组跟实验组的蛋白都检测出来了？我用的一抗可能浓度也太高，用了1：100，第一次做防止检测不出来。。。但是一抗的特异性不错，就一条蛋白band。但是非常非常强的信号。。还有我的上样量如果很大程度的稀释，可以减少非特异结合么？现在疑问就是还有没有希望试一下稀释一抗，稀释上样量，然后能至少看出量的区别呢？我觉得pg就可以检测出来的话，western很难能分出blank跟实验组的区别吧？有点崩溃，特别崩溃！希望大家指点！！！！！！
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1楼 2013-05-09 12:39:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
iamvivien: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-22 08:08:09
我见到实验手册，一抗和二抗都可以稀释到1:100-1:15000
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    • 2013-05-09 16:10:23, 10.74 M
4楼2013-05-09 16:03:01
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
iamvivien(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-09 20:53:10
你在抗体孵育的牛奶或者BSA用量和时间是否足够，个不清洗过程是不是足够。因为抗体-抗原相互作用的接触面积一般是1500-1700平方埃，而一个氨基酸残基的表面积是100-200平方埃，所以如果另个抗原的免疫决定簇正好有6-8个氨基酸残基序列相同，存在交叉反应的可能是存在的。所以，你可以适当稀释二抗的浓度先试试，不行在稀释一抗和样品浓度。
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2楼2013-05-09 14:21:01
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iamvivien

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-09 14:21:01
你在抗体孵育的牛奶或者BSA用量和时间是否足够，个不清洗过程是不是足够。因为抗体-抗原相互作用的接触面积一般是1500-1700平方埃，而一个氨基酸残基的表面积是100-200平方埃，所以如果另个抗原的免疫决定簇正好有6 ...

感谢回复！我二抗是1：10000的浓度。BSA用的是3% in TTBS, block了过夜，在四度。一抗是3小时，室温，1：100 in 3% BSA, 然后rinse了两遍后，再用TTBS洗了三遍，每次10分钟，然后加的二抗，一小时室温，1：10000 in TTBS， 最后洗的时候也是先rinse，再三遍的十分钟。买的一抗上面说是N端的2-33个氨基酸。有另外一个蛋白我在空白组的质谱上面发现过，可能不是特异蛋白，是同一个family的，序列重合度跟我的目标蛋白很高。。。。就是有可能识别的是另外这个蛋白？但是这样的话至少应该看到两条蛋白带吧？不过这两个蛋白一上一下，大小很接近。可能我的蛋白带太浓，很粗，完全分不清楚也有可能。。。

二抗您觉得应该稀释到多少呢？
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3楼2013-05-09 15:54:12
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