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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 跪求：蛋白质电泳条带老是跑不开去怎么办
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶的问题，分离胶的问题
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
11楼2013-05-10 10:05:06
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hello青果: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-05-11 18:31:46
数了半天才找到是9楼，说的对！是你的电泳液的问题，你所谓的电泳时间不是你的有效电泳时间！建议使用新的电泳液，在电泳初始阶段看看气泡是不是均匀的从底部升起而不是那种像烟花似的一丝丝的上来。一般国内实验室省点钱都让学生反复使用电泳液。此外你在电泳过程中要看看电源有没有报错，一般我使用伯乐的mini系统，2块胶200v,40-45min 12%的胶(29:1),一块胶建议使用横流35mA,35min 同上12%的胶。我的建议是每次电泳时候内槽一定用新配的。关于你的胶的试剂什么的我认为都没有问题，一个实验室一般这些东西都是共享的！多像实验室的研究生问问。刚开始实验都是这样的！
希望对你有用。
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12楼2013-05-10 10:51:26
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百目充

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以尝试浓缩胶恒压60v，分离胶恒压120V，大概2.5h可以跑完。。
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未来不是梦。。。
13楼2013-05-10 13:32:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

DS电泳太慢和带弥散的改进措施

建议改进措施:
1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。
2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
3.使用全新配置的缓冲溶液。
4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。
5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。
7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液。
9.分离胶的浓度应高于浓缩胶，但是胶浓度高会引起电泳时间变长，电泳时间会引起电泳带弥散。具体的参考的凝胶浓度参见附录。
控制好电泳时间，别把样品跑出了胶外。

附录：
1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
2.在SDS-PAGE不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系：
聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd
5                      36—200
7.5                    24—200
10                     14—200
12.5                   14—100
15                     14—60
浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。

2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。

以上材料的主要参考文献是：
吕宪禹 主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工业出版社，2010，第13章。

（建议仅供参考）
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14楼2013-10-02 20:18:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：标题是：“SDS电泳太慢和带弥散的改进措施”。
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15楼2013-10-02 20:18:56
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