| 查看: 2302 | 回复: 24 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
[求助]
蛋白破碎后，上清的活性很低
|
|||||
|
各位好心人，我最近在做蛋白表达。全细胞的酶活很高，用超声破碎后，破碎后上清活性很低，但沉淀的活性很高。蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。我想应该是破碎不完全吧。我的破碎条件是这样的：破碎1s，暂停2s。总共这样循环破1h，功率45%。 各位做蛋白表达的同志们，能否给我些建议，我想我这应该不是形成包涵体吧，但是都破碎了1h了，沉淀中还是有好多目的蛋白。 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有223人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
|
蛋白质沉淀就一定没有活性？---------搞笑吧！ 固定化酶有没有生物学活性？？ PrP(scrapie)有没有生物活性？？： 参考文献举例： 【荷兰】曹荻秋(Linqiu Cao) 著，杨晟、袁中一 译，载体固定化酶----原理、应用和设计，化学工业出版社，2008； Stanley B.Prusiner,Prion Biology and Diseases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2004,Second Edition. ----------如果淀粉状沉淀的PrP(scrapie)没有生物活性，那么克-雅氏综合征和疯牛病都不存在了！而且如果有人能够证明蛋白质沉淀就一定没有生物活性，那么其足以否定Stanley B.Prusiner的1997年诺贝尔化学奖！！我不知道论坛现在就能有如此大神！！ |
24楼2013-05-10 13:20:28
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
2楼2013-05-07 21:55:22
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
3楼2013-05-07 21:57:30
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
|
既然不清楚“固定化”酶本身与非酶的介质之间的链接到底是什么？那么可以先用破坏非共价键的把“固定化”酶从介质上解脱下来。比如用加入一些表面活性剂破坏“固定化”酶本身与非酶的介质之间的疏水相互作用，然后离心试试看。比如可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用，然后过层析住加以分离；或者用硫酸铵沉淀蛋白质-----分离蛋白质与生物大分子，而后除去硫酸铵再用用层析；如果酶石墨蛋白质则可用丙酮分级分离；另外疏水层析和离子交换树脂也可以用上；实在分离不开就用SDS-PAGE电泳分离，然后回收凝胶中 的蛋白质再进行复性。 |
4楼2013-05-07 22:09:57