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[求助]
免疫组化酶标出现的问题求分析
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因为我用的是之前病理科没有做过的抗体SFRP1，所以尚在摸索条件阶段，几次预实验做下来，效果都不好，故求助，希望得到又经验的虫友们指导。 总的来说，要么非特异性染色（背景染色）很强，滴加DAB后几秒钟就出现棕黄色改变，弥漫性的。要么就全部阴性结果，或弱阳性，无法区分是否是实验操作的问题，还是抗原本身的有无。有时候又苏木素核染色很强，组织弥漫性蓝色深染。 求指导的几个要点是： 1，抗原修复液的配制。第一次因为背景染色强，第二次调整了抗原修复液的PH（用的tris-EDTA，由pH8.0降至pH6.5)。用的是微波修复，解冻档。2*5min。我用的是3mM Tris+ 0.4mM EDTA 然后用浓盐酸调pH. 2.TBS的配制。我用的是20gTris 溶解于1000ml蒸馏水，加浓盐酸调pH到7.5左右。浓度大概是0.165mol/L。 3.苏木素染色5-6min，然后凉水冲洗，然后1%盐酸酒精分化（2秒）,然后热水冲洗反蓝。但是有的片子效果会是蓝色很深。有的片子核就染的很轻。求指导！ 4，脱蜡时间是否越长越好？因为用的是公用的二甲苯，所以是在里面室温40-50分钟，怎样看是否脱蜡干净？ 5，在开始和结束的时候都用到梯度酒精，是每个浓度的放置1分钟，还是蘸一下就拿出来？ 6，关于洗TBS，是放置在其中浸泡3-5分钟，还是涮几下？ 7，关于抗体稀释液，是用1%牛血清溶液稀释好，还是TBS稀释好？如果用1%小牛血清溶液稀释，是否还需要用5%牛血清封闭液封闭？ 8，稀释后的DAB最多能够在4度冰箱里放置多久？过夜的是否可以使用? 因为用了放了2天的稀释后避光4度保存的DAB，全部是阴性结果，无法判断是DAB失效，还是抗原阴性。 9，因为不可能每调整一个步骤都做阳性阴性对照，因为阳性组织不好找，所以只能是通过调整试验步骤达到基本符合预期的效果。但是操作又实在是没有经验，所以不懂怎么分析和调整。 效果做出来实在是差别千万里，每个步骤更改过后得到的结果又总是不特别理想。因为是新手，每个环节都可能存在错误，贴在这里，希望得到有经验人士的指导。非常感谢！ |
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