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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体很久了就是不长斑，急急急！！！
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

目的片段酶切有问题。
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静心做事。
11楼2013-04-24 07:58:10
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-28 13:52:03
回收之后，测一下浓度，然后按mol浓度载体比目的1：3-10连接，10ul连接产物全部加入感受态里转化。同时做一个质粒转化同样的感受态做阳性对照，做一个只涂感受态的阴性对照。另外可以用T4 DNA 连接酶做一下，看是不是solution1是不是失效了。
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12楼2013-04-24 09:57:44
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带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-28 13:52:22
引用回帖:
9楼: Originally posted by zsewqa129 at 2013-04-23 20:03:05
摩尔比怎么算呀，呵呵，这个不懂...

举个例子
同样100毫克的DNA
载体5000bp   目的片段500bp
摩尔比     载体：目的片段=1:10
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加油
13楼2013-04-24 15:27:24
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
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14楼2013-04-25 16:57:46
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
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15楼2013-04-25 17:05:47
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
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16楼2013-04-25 17:11:48
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 13:52:36
由于不了解情况，根据lz提供的信息，只能猜测是否是以下原因：
1、回收是否有问题？看回收后的胶，目的片段涂抹，没有带。
2、载体和目的片段是否加够量？可以这样估算：在10uL体系里，载体加（长度/100）ng=70ng，目的片段加（长度/10）ng=50ng。这个比较粗放，差个一两倍没关系，东西多就多加点，少就少加点。DNA的浓度用分光光度计测，对于普通的光度计，回收后取1uL稀释到100uL测吸光。
3、载体或者片段自身没问题？要来的载体（尤其是国内的）实际序列常常和图谱不一样。你以为酶切位点是HindIII-NNNNN-SalI，实际它是HindIII-NNNNN-SalI-HindII。
4、HindIII和SalI之间的是什么序列，会不会关系到质粒自身的生死存亡？
5、你的目的片段是怎么来的？PCR产物？有保护碱基没有？
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17楼2013-04-25 22:50:36
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bloodwar

银虫 (小有名气)
感觉模板量好少啊
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18楼2013-04-26 09:54:02
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
19楼2013-04-28 08:40:50
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
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20楼2013-04-28 08:42:15
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