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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

目的片段酶切有问题。
静心做事。
11楼2013-04-24 07:58:10
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-04-28 13:52:03
回收之后,测一下浓度,然后按mol浓度载体比目的1:3-10连接,10ul连接产物全部加入感受态里转化。同时做一个质粒转化同样的感受态做阳性对照,做一个只涂感受态的阴性对照。另外可以用T4 DNA 连接酶做一下,看是不是solution1是不是失效了。
12楼2013-04-24 09:57:44
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带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)


gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-04-28 13:52:22
引用回帖:
9楼: Originally posted by zsewqa129 at 2013-04-23 20:03:05
摩尔比怎么算呀,呵呵,这个不懂...

举个例子
同样100毫克的DNA
载体5000bp   目的片段500bp
摩尔比     载体:目的片段=1:10
加油
13楼2013-04-24 15:27:24
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)

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14楼2013-04-25 16:57:46
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zsewqa129

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15楼2013-04-25 17:05:47
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zsewqa129

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16楼2013-04-25 17:11:48
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-04-28 13:52:36
由于不了解情况,根据lz提供的信息,只能猜测是否是以下原因:
1、回收是否有问题?看回收后的胶,目的片段涂抹,没有带。
2、载体和目的片段是否加够量?可以这样估算:在10uL体系里,载体加(长度/100)ng=70ng,目的片段加(长度/10)ng=50ng。这个比较粗放,差个一两倍没关系,东西多就多加点,少就少加点。DNA的浓度用分光光度计测,对于普通的光度计,回收后取1uL稀释到100uL测吸光。
3、载体或者片段自身没问题?要来的载体(尤其是国内的)实际序列常常和图谱不一样。你以为酶切位点是HindIII-NNNNN-SalI,实际它是HindIII-NNNNN-SalI-HindII。
4、HindIII和SalI之间的是什么序列,会不会关系到质粒自身的生死存亡?
5、你的目的片段是怎么来的?PCR产物?有保护碱基没有?
17楼2013-04-25 22:50:36
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bloodwar

银虫 (小有名气)

感觉模板量好少啊
18楼2013-04-26 09:54:02
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zsewqa129

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19楼2013-04-28 08:40:50
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zsewqa129

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20楼2013-04-28 08:42:15
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