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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体很久了就是不长斑，急急急！！！
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zsewqa129

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2013-04-19 09:13:22
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 13:52:36
由于不了解情况，根据lz提供的信息，只能猜测是否是以下原因：
1、回收是否有问题？看回收后的胶，目的片段涂抹，没有带。
2、载体和目的片段是否加够量？可以这样估算：在10uL体系里，载体加（长度/100）ng=70ng，目的片段加（长度/10）ng=50ng。这个比较粗放，差个一两倍没关系，东西多就多加点，少就少加点。DNA的浓度用分光光度计测，对于普通的光度计，回收后取1uL稀释到100uL测吸光。
3、载体或者片段自身没问题？要来的载体（尤其是国内的）实际序列常常和图谱不一样。你以为酶切位点是HindIII-NNNNN-SalI，实际它是HindIII-NNNNN-SalI-HindII。
4、HindIII和SalI之间的是什么序列，会不会关系到质粒自身的生死存亡？
5、你的目的片段是怎么来的？PCR产物？有保护碱基没有？
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17楼2013-04-25 22:50:36
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sl35537417

木虫 (正式写手)
一步步地确定 就会找到问题
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2楼2013-04-19 09:29:25
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带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 21:00:56
酶切你切的是什么？注意以下链接比例，小片段：大片段=3-10:1，体系不要大
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加油
3楼2013-04-19 09:30:43
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 21:01:06
每一步的图片发过来看看 ，你回收的怎么样？酶切的怎么样？连接体系是什么？转化过程是什么？每一步都说清楚，这样才可能分析原因。
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4楼2013-04-19 11:34:06
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