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mm3545

新虫 (小有名气)

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[交流] 求有经验的教我怎么做真菌石斛小菇的原生质体

本人现在在做石斛小菇的原生质体，该真菌细胞壁多糖比较多，生长也比较慢，做原生质体的时候，我用了两个方案
1、蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶的混合液；
2、lysing Enzymes(sigma)；
各酶的浓度都是0.25克。温度是30度，消化了很长时间都没多少原生质体。
请高手有经验的教我！！实验过程中需要注意什么，最好有个步骤给我！

这个是我的步骤：
2.1菌体培养：PDA（土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂）。
2.2大量菌丝产生：PDB培养
2.3菌丝碎片收集：菌丝磨碎（磨碎机打磨，注意温度不能过高），离心收集。50ml离心管 8000rpm 10min，YEPD清洗一次。
2.4幼植体培养：将菌丝碎片加入YEPD培养基中，25度200rpm 摇菌过夜（用于产生新鲜的菌丝进行原生质体裂解）。
2.5菌丝收集：灭菌漏斗、擦镜纸过滤，收集新鲜菌丝。并用0.7 M NaCl等渗液洗涤。
2.6将细胞壁降解酶(蜗牛酶、溶菌酶、纤维素酶各0.2g或lysing enzymes 0.2g)用20 ml 0.7 M NaCl等渗液溶解，细菌滤器过滤。加入菌丝。30度100rpm 酶解2-3h。显微镜查看
2.7擦镜纸过滤至50ml离心管，收集过滤液（含原生质体）

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