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我晴天一片

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因与载体连接转化后涂版长出了菌，提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？

基因与载体PET-28a连接转化后涂板长出了菌，挑单克隆后摇试管提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？是连接失败还是怎么回事？连接失败的原因是什么呢？
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1楼2013-04-07 10:56:06
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swallow_sun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-09 18:02:21
做连接首先你要确定一下几点：
1、抗生素是否失效（抗性平板直接涂布感受态细胞）
2、质粒转化感受态做阳性对照
3、胶回收的酶切产物电泳验证是否有条带
4、质粒试剂盒提个带质粒的菌做对照
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14楼2013-04-09 17:46:49
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shangming

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。生物版块欢迎你的无私奉献。 2013-04-07 11:53:02
用的是amp抗性的话，培养12h左右长出来的才是抗性菌落，时间再长amp抗性就失效了，然后就会长出很多卫星菌落，这些卫星菌落基本上不含质粒，所以你在抗性培养基中培养长不出来。
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2楼2013-04-07 11:12:34
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留小保

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能连接失败有可能是提取质粒出问题
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人生若只如初见 何事秋风悲画扇
3楼2013-04-07 11:22:31
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:13
ls回答前至少看一下吧 pet28a的抗性是kan  没卫星菌落的
LZ可以的话先做个colony pcr预筛选下。
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4楼2013-04-07 11:23:00
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