24小时热门版块排行榜

返回列表

当前主题已经存档。

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lccj158

木虫 (正式写手)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 2747
红花: 6
帖子: 783
在线: 761.8小时
虫号: 281802
注册: 2006-09-23
性别: GG

[交流] [求助]关于southern杂交问题

小弟最近做southern.折腾了快20天了，目前一点结果都没有。老板天天催，急啊，请各位大哥大姐帮我分析分析，我的问题在那。谢谢啊！

我用的是Roche的盒子（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ）。我的操作步骤如下：

1。探针制备：从基因组中扩出160bp的片段，进行凝胶回收（omega的盒子），浓度测定0.15微克/微升，然后按标记说明书进行，在PCR管里加

NA:8微升（约1微克），8微升的蒸馏水,然后在沸水中煮沸10分钟，之后快速置于冷水中5分钟，最后加4微升的DIG-High Prime混匀、稍加离心，置于37度培养箱中反应15小时，反应结束后放置65度水浴中10分钟来终止反应。

2.基因组的酶切：取3－5微克基因组酶切12小时，电泳45伏，6小时（由于上样量较大，所以我的胶比较厚）

3.转膜：我用的尼龙膜为是osmonics的，常温下毛细管转15小时。洗膜后在120度下将膜烘烤30分钟。

4.预杂交、杂交：将盒子里带有的杂交液（粉状DIG Easy Hyb Granules），按要求稀释。68度预杂交30分钟，68度杂交15小时。

5.洗膜、检测：用CSPD进行检测，完全按说明书进行。

最后结果为，只有一些模糊的黑色，更本看不到像带一样的东西，泳道都没有。高手求助啊

1.是不是探针没有标上（因为我没有检测探针的标记效率）

2.杂交膜是不是有问题

3.基因组上样是不是太少

[ Last edited by johnsooh on 2007-9-10 at 20:56 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

求助:我三月中下旬出站，青基依托单位怎么办？已经有11人回复
不自信的我已经有12人回复
假如你的研究生提出不合理要求已经有5人回复
所感已经有4人回复
论文终于录用啦！满足毕业条件了已经有28人回复
要不要辞职读博？已经有7人回复
北核录用已经有3人回复
实验室接单子已经有3人回复
磺酰氟产物，毕不了业了！已经有8人回复
26申博（荧光探针方向，有机合成）已经有4人回复

1楼 2007-09-10 15:21:25

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain

BioEPI: 7
应助: 18 (小学生)
贵宾: 1.893
金币: 11090
红花: 22
帖子: 1971
在线: 261.3小时
虫号: 345402
注册: 2007-04-14
专业: 临床生物化学检验

仅供参考！！！

★ ★
johnsooh(金币+2,VIP+0):多谢斑斑指导

我曾经也作过这个
做的事检测端粒的长度
我个人认为，只要酶切完跑电泳，紫外下能看到smear就可以，转膜我用的是老办法－毛细管转－用吸水纸（－求实就是质量好的卫生纸）来搞定，然后压重物转过夜，没问题的。然后紫外交联。再杂交。
我当时遇到的问题是，杂交温度不对。很多文献、试剂盒都推荐48度，甚至更高68度，为了提高特异性。
我用的不是试剂盒，按他们介绍的怎么也做不出来。后来看了一个公司的试剂盒说明，发现oligo探针杂交温度建议37左右度好。所以我敞开杂交炉做的－炉子的温度下不来，就有了结果。
关于探针标记，我觉得你用盒子应该没有问题吧。我不用盒子，拿T4PNK（好像是这个名）标记的一点问题也没有。当然开始没做出来，以为是探针的事，也作过2次标记，过柱子等。最后发现沉淀探针并加糖原不错（糖原可以挂在探针上，这样肉眼就能看到沉淀不会倒掉探针，糖原不影响试验，可惜那个文献我找不到了）。