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[求助]关于southern杂交问题
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小弟最近做southern.折腾了快20天了，目前一点结果都没有。老板天天催，急啊，请各位大哥大姐帮我分析分析，我的问题在那。谢谢啊！ 我用的是Roche的盒子（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ）。我的操作步骤如下： 1。探针制备：从基因组中扩出160bp的片段，进行凝胶回收（omega的盒子），浓度测定0.15微克/微升，然后按标记说明书进行，在PCR管里加  NA:8微升（约1微克），8微升的蒸馏水,然后在沸水中煮沸10分钟，之后快速置于冷水中5分钟，最后加4微升的DIG-High Prime混匀、稍加离心，置于37度培养箱中反应15小时，反应结束后放置65度水浴中10分钟来终止反应。2.基因组的酶切：取3－5微克基因组酶切12小时，电泳45伏，6小时（由于上样量较大，所以我的胶比较厚） 3.转膜：我用的尼龙膜为是osmonics的，常温下毛细管转15小时。洗膜后在120度下将膜烘烤30分钟。 4.预杂交、杂交：将盒子里带有的杂交液（粉状DIG Easy Hyb Granules），按要求稀释。68度预杂交30分钟，68度杂交15小时。 5.洗膜、检测：用CSPD进行检测，完全按说明书进行。 最后结果为，只有一些模糊的黑色，更本看不到像带一样的东西，泳道都没有。高手求助啊 1.是不是探针没有标上（因为我没有检测探针的标记效率） 2.杂交膜是不是有问题 3.基因组上样是不是太少 [ Last edited by johnsooh on 2007-9-10 at 20:56 ] |
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2楼2007-09-10 18:01:46
vivalk
捐助贵宾 (著名写手)
Just so so
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- 贵宾: 8.55
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3楼2007-10-09 06:03:11
guohuayin
木虫 (著名写手)
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- 专业: 植物病理学
4楼2007-10-09 07:15:29
仅供参考！！！
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johnsooh(金币+2,VIP+0):多谢斑斑指导
johnsooh(金币+2,VIP+0):多谢斑斑指导
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我曾经也作过这个 做的事检测端粒的长度 我个人认为，只要酶切完跑电泳，紫外下能看到smear就可以，转膜我用的是老办法－毛细管转－用吸水纸（－求实就是质量好的卫生纸）来搞定，然后压重物转过夜，没问题的。然后紫外交联。再杂交。 我当时遇到的问题是，杂交温度不对。很多文献、试剂盒都推荐48度，甚至更高68度，为了提高特异性。 我用的不是试剂盒，按他们介绍的怎么也做不出来。后来看了一个公司的试剂盒说明，发现oligo探针杂交温度建议37左右度好。所以我敞开杂交炉做的－炉子的温度下不来，就有了结果。 关于探针标记，我觉得你用盒子应该没有问题吧。我不用盒子，拿T4PNK（好像是这个名）标记的一点问题也没有。 当然开始没做出来，以为是探针的事，也作过2次标记，过柱子等。最后发现沉淀探针并加糖原不错（糖原可以挂在探针上，这样肉眼就能看到沉淀不会倒掉探针，糖原不影响试验，可惜那个文献我找不到了）。 |
5楼2007-10-09 08:59:43
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