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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 引物和测序
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Le_science

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物和测序

最近做试验，老师给了一段序列。然后用颜色标记了，前面10多个碱基设计成了forward primer, 后面的碱基反向设计成了reverse primer.  然后跑PCR，看能不能扩得出，然后接着好像是克隆，然后测序。

我有问题不明白。既然序列都给了，为什么还要测序啊，这样测出来的不就是两个引物之间的序列么。第二，为什么不直接PCR，纯化，测序；而要来个克隆测全长啊？而且老师给引物后就让跑PCR， 然后看下能不能P出来，这样P一下的意义是什么啊？？看引物行不行？程序OK不？
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1楼 2013-04-02 06:18:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR时候会有错配几率的，所以经过PCR后的需要测序验证克隆序列的正确性。PCR产物跑电泳虽然看起来是一条带，实际上反应是经过多个循环把模板片段大量扩增出来的，很可能是分子量接近的不同分子，所以需要克隆后挑单克隆再测序。因为每个克隆出来的序列是插入了一个分子形成的，而纯化PCR产物测序的话本身可能就是一个混合物，最后那个分子连到载体里面去还不知道。用导师给的引物PCR是验证引物是否能进行克隆或者其他实验。
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3楼2013-04-02 15:55:43
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一。测序是为了确定你克隆出来的载体中连接的目的基因序列和老师给的是否一样，因为在后续的PCR中会有碱基发生错配，导致序列中个别碱基发生变化。
二。直接PCR，纯化测序，估计是没有多大意义吧。克隆之后拿给测序公司进行测序时还要把自己引物告诉他们，别人并不是测全长的，只是测目的基因序列。
P的意义是看引物行不行，程序OK不。
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2楼2013-04-02 13:08:17
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