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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急求，平滑肌细胞过夜没贴壁？什么原因
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snake-M

新虫 (初入文坛)

[求助] 急求，平滑肌细胞过夜没贴壁？什么原因

昨天新定的冻存细胞到了，复苏过夜后发现一个贴壁细胞没有，我的操作应该是没有问题的， 7ml培养液+1ml冻存管里的细胞悬液，1000转/分 5分钟离心。加5ml培养液悬匀，转移到培养瓶。我现在严重怀疑是我的培养基出现问题了，我的培养基是这样配的，D/F12+10%FBS+1%双抗。。。是双抗浓度太大么还是血清浓度过低？这个突然结果摧毁了我的全部信心，希望大家能帮我一下，，，第一次养平滑肌细胞，情况一点都没摸清，特别希望有哪位前辈指点我一下，真是不胜感激！非常非常非常感谢啊
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1楼 2013-03-25 19:30:03
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Rio2016

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 鼓励发帖交流 2013-03-26 06:42:42
如果细胞没死、且形态异常、可能是因为冻存的细胞活性会降低、特别是时间特别长的、传代试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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寥寥数年、将就过活
3楼2013-03-25 22:56:50
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snake-M

新虫 (初入文坛)
还有一个问题就是原代培养的平滑肌细胞能用来做cck8实验么？有成纤维细胞干扰吧？
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2楼2013-03-25 21:23:40
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, BioEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-27 21:04:56
snake-M: 金币+3 2013-04-09 10:11:27
没有贴壁生长的主要原因可能是：
组织块的大小剪的不合理，一般1MM2最合适，过大增加细胞萌发出阻力。而且组织块边缘要整齐，光滑。
再就是你剥除内膜外膜时候的受力可能不合理，机械拉伤细胞，剪的时候尽量一次剪断。
还有你切组织块的时候可能离开培养液操作的，没有保持边缘湿润。
最可能是没有尽量去除周围的脂肪和结蹄组织，还有接触表面要尽可能的大。
1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然先天不足；
2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；
3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；
4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。
5、培液Gibco的 DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。
建议用1次性培养瓶，成功机会大于玻璃瓶。成功后再小心过度成玻璃瓶。块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好。组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了。
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4楼2013-03-27 20:08:17
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