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snake-M新虫 (初入文坛)
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[求助]
急求，平滑肌细胞过夜没贴壁？什么原因
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| 昨天新定的冻存细胞到了，复苏过夜后发现一个贴壁细胞没有，我的操作应该是没有问题的， 7ml培养液+1ml冻存管里的细胞悬液，1000转/分 5分钟离心。加5ml培养液悬匀，转移到培养瓶。我现在严重怀疑是我的培养基出现问题了，我的培养基是这样配的，D/F12+10%FBS+1%双抗。。。是双抗浓度太大么还是血清浓度过低？这个突然结果摧毁了我的全部信心，希望大家能帮我一下，，，第一次养平滑肌细胞，情况一点都没摸清，特别希望有哪位前辈指点我一下，真是不胜感激！非常非常非常感谢啊 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, BioEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-27 21:04:56
snake-M: 金币+3 2013-04-09 10:11:27
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, BioEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-27 21:04:56
snake-M: 金币+3 2013-04-09 10:11:27
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没有贴壁生长的主要原因可能是： 组织块的大小剪的不合理，一般1MM2最合适，过大增加细胞萌发出阻力。而且组织块边缘要整齐，光滑。 再就是你剥除内膜外膜时候的受力可能不合理，机械拉伤细胞，剪的时候尽量一次剪断。 还有你切组织块的时候可能离开培养液操作的，没有保持边缘湿润。 最可能是没有尽量去除周围的脂肪和结蹄组织，还有接触表面要尽可能的大。 1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然先天不足； 2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪； 3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻； 4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。 5、培液Gibco的 DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。 建议用1次性培养瓶，成功机会大于玻璃瓶。成功后再小心过度成玻璃瓶。块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好。组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了。 |
4楼2013-03-27 20:08:17
snake-M
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