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求助，关于DMEM培养液，双抗，血清等问题
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本人新手，正在准备养293T细胞。老师买了现成的DMEM高糖培养液，呈大红色的。然后吩咐我加双抗还有血清，还要分装。 我现在就有很多疑问。。。 1、我们实验室的双抗是买一小瓶一小瓶粉状的，由于做实验的人不是连续的，所以所有试剂都要新配置，也不能配置很多，会造成浪费。不能采取一次性配一瓶的办法。 我想问关于双抗配置的，我现在要10ml青霉素链霉素双抗，50000、100000U/ML。称量时可否暴露在空气中，在配置的时候，可不可以直接用没有高压的PBS溶解，配完再过滤除菌，分装在无菌的EP里面，-20冻存即可？还有一年前配置的，一直冻在-20℃的还可以用么？ 2、关于血清和分装，由于我养的细胞量小，不需要很多DMEM液，老师让我分装出100ml一瓶。我想问，分装过程是在无菌间操作，然后再加双抗和血清？还是血清到最后要养细胞了才加？DMEM如果加了双抗和血清能不能冻在-20℃，保存2周左右？ 我从公司买回来的现成的DMEM不用过滤除菌了吧？到时候分装和加双抗血清全部在无菌间操作就能保证无菌了吧。。 3、293T细胞是一年前液氮冻存的。。现在我解冻重新培养，存活率会不会很差。。还有我查看了好多关于细胞复苏的视频和流程，是否离心是必要的呢？很多参考是写要加入10ml培养基，离心1000rpm，5分种，吸掉上清液再加10ml培养基再转移到培养瓶里面。也有的写直接加入10ml养24个小时以后，倾倒掉上清液，再加10ml养24个小时。不知道有没有达人有经验。。我第一次养细胞。。也没有师兄教。。所有都在摸索中。。 |
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3楼2013-03-12 16:59:46
henryxue
木虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 感谢详细的分析 2013-03-13 08:34:24
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wizardfan: 金币+3, 感谢详细的分析 2013-03-13 08:34:24
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1. 可以，因为你后面会过滤除菌，所以前面怎么配都是不影响的，要用0.22um的过滤，0.45的除菌不完全，冻-20没有问题，一年前的应该也能用。双抗养细胞时其实可以不加，毕竟是会影响一些细胞状态的，但是可以降低操作过程中的无菌要求，如果不小心细胞出现污染了，而且没有备份的细胞，最高浓度也可以尝试10%双抗杀杀看的。所以如果你担心一年前的不好用，你可以把一年前的按2%往里加，或者你无菌操作加强，按照1%的加也没问题。 2. 公司买的液体一般都是过滤好的，因为你们不连续做实验，无菌操作下先分出100mL再加血清双抗即可，不要保存-20，4度保存2周完全没问题的，只要瓶子密封些就可以了，如果培液用得很慢，可以分成50mL一瓶，每次养细胞前就预热那50mL的，培液太多次加热也不是很好 3. 离心等等的问题主要是冻存过程中用了DMSO，而这个东西在培养细胞时对细胞生长是不利的，个人是建议你离心去除比较好，不一定要10mL培液，我操作中就是5mL，主要就是去除大部分的DMSO用。至于存活率的问题，液氮中1年并不是很久的，主要是细胞冻存前的状态是不是很好才是影响的关键。你在复苏完后， 不推荐你每几个小时就去看看，因为细胞在刚复苏的时候状态还是比较脆弱的。个人推荐是在刚复苏的那半周里面，每天最多看一次，如果第一天细胞没有长到密度超过50%，就继续培养，否则推荐换一次液，如果第二天密度超过90%，可以传代，如果细胞还是比较稀（密度小于50%），就换一下液 |
2楼2013-03-12 08:45:07