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腐竹中巯基与二硫键的测量
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ellman's法测定腐竹中的巯基与二硫键时，操作方法为： 75mg腐竹样品，研碎，用1mlTris-甘氨酸缓冲液混匀后]加4.7g盐酸胍，用缓冲液定容至10ml。 测定巯基时，取1ml该液加4ml脲-盐酸胍溶液和0.05mlEllman’s试剂，于412nm处测定光吸收值。 测定二硫键时，取1mL溶液，加0.05mL巯基乙醇和4mL脲-盐酸胍溶液，于25℃保温1h，然后加入10ml12%三氯乙酸，维持于25℃恒温1h，5000xG离心10分钟，用5ml12%三氯乙酸清洗沉淀物两次，将沉淀物溶于10ml8M脲中，加0.04mlEllman’s试剂，测取412nm处的吸光值。 请问为什么要在混匀后 直接加盐酸胍固体，该操作可以如何改进，减少称量时的误差？麻烦各位了  |
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conanzzz
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
3楼2015-09-29 09:11:18