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放射免疫分析法原理及操作技术
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竞争性RIA 竞争性RIA，又称传统RIA，主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag +已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物Ag Ab+游离标记抗原Ag （去除）（未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关）。 临床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），铁蛋白（Fer），人绒毛膜促性腺激素p亚单位（HCG-13）等的检测都是竞争性RIA法原理。竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，将非标记抗原（被测物与标准品）、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂分离B（复合物）与F（游离物）如：AFP，8 一MG，Fer；顺序加样法，先将非标记抗原（被测物与标准品），与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B与F如：CEA；急诊检测法：为临床急需检测结果而提出的反应方式，不等RIA 反应达到动态平衡就终止反应；分离剂的选择有，PEG（聚乙二醇），第二抗体等。 现在一般采用的是：第二抗体与PEG合用的方法，称为双抗体一PEG法。 PEG原理：PEG浓度达到7 一9 时能使抗原一抗体复合物沉淀。 优点：经济，简便，通用。 缺点：重复性差，非特异性结合率高。 第二抗体：第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体，来自家兔或豚鼠。用第一抗体为抗原，作用到羊，马身上，产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合，生成分子量很大的免疫复合物（AgAb ×Ab ），能自然沉淀。 优点：分离效果好。非特异性结合率低。 缺点：增加经费投入。需要第二次温育，延长了时间。 所以就产生了两者合用的双抗体一PEG法，它结合了上述两种方法的优点。 非竞争性RIA 非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA）主要特点：标记的是抗体。 按反应原理分为两种： （一）单位点IRMA 其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（负相关）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（过剩的，游离的）：（ImAd—Ab）固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体。 （二）双位点IRMA，又称双抗体夹心法 从加样测定顺序上看，有三种方法：固相抗体先与未知抗原结合，再与标记抗体结合（正向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原先与标记抗体结合，再与同相抗体结合（反向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应（一步法，又称同时加样法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。这三种方法都生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，故又称双抗体夹心法。 糖类抗原CA50，CA125就用的是其中的第三种方法（一步法），血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。 全球抗体搜索引擎，国内首个抗体基因数据库。 |
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2楼2013-01-25 18:59:07
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